Všechny metody byly provedeny v souladu s příslušnými pokyny a předpisy. Informovaný souhlas byl získán od všech subjektů.
Materiál
tyto stříbrné obvazy byly porovnány: Acticoat (Smith&Synovec, UK; uvedené v tomto článku jako Ac), Aquacel Ag + Extra (Convatec, UK; uvedené v tomto článku jako Aq), Silvercel Hydro-Alginát (Systagenix, UK; uvedené v tomto článku jako Sc), a Ialugen Plus (IBI, česká Republika; uvedené v tomto článku jako Ia).
Další chemikálie byly získány od Sigma–Aldrich (St. Louis, USA) pokud není uvedeno jinak.
Příprava extraktů
v několika testech byly použity extrakty z obvazů spíše než samotné obvazy. Tyto extrakty byly připraveny za použití fyziologického fyziologického roztoku (0,9% (w/v) NaCl) nebo buněčného kultivačního média doplněného 10% fetálním bovinním sérem (FBS). Poměr obvazové plochy k roztoku byl 1 cm2 na 4 mL roztoku. Extrakce byla prováděna po dobu 72 hodin při RT s konstantním mícháním. Extrakty byly sterilizovány průchodem přes 0,2 µm filtr a skladovány při 4 °C až do použití.
měření koncentrace stříbra
koncentrace stříbra v obvazech a extrakty obvazů byly měřeny pomocí ICP-OES. Koncentrace stříbra byla také hodnocena ve vzorcích kůže prasat ex vivo. 10-70 mg každého vzorku bylo přeneseno do nádoby PTFE pro mikrovlnné trávení. Poté 1 mL koncentrované kyseliny dusičné (trace analysis grade, Analytika s. r. o., ČR), 0.8 mL koncentrované kyseliny chlorovodíkové (trace analysis grade, Analytika s. r. o., Česká republika) a 0,2 mL peroxidu vodíku (p. a. 30%, Penta s. r. o., Česká republika) byly přidány. Vzorek byl štěpen při 150 °C po dobu 5 minut a poté ve druhém kroku téhož cyklu při 200 °C po dobu 10 minut. Po rozštěpení byl vzorek kvantitativně přenesen za použití 0,2 mL peroxidu vodíku a deionizované vody.
analýza byla provedena pomocí ICP-OES nástroje (Radiální 725, Agilent Technologies, Austrálie) je vybaven pneumatickým Moře, sprej, k rozprašování a cyklónové stříkací komory. Kvantifikace byla založena na externí kalibraci. Přesnost a spolehlivost metody byly testovány s použitím vzorků kůže prasat se známými koncentracemi Ag z certifikovaného referenčního roztoku (Analytika Ltd., ČR).
skenovací elektronová mikroskopie
analýzy skenovací elektronové mikroskopie (SEM) byly provedeny pomocí nástroje Zeiss Ultra Plus (Zeiss, Německo). Vzorky byly potaženy tenkou vrstvou Au / Pd v rozprašovači Quorum SC7620. Snímky byly pořízeny dvěma sekundárními detektory InLens a SE2 elektronů pro vyšší nebo nižší zvětšení. Parametry skenování byly následující: zrychlující napětí, 3,5 kV; proud sondy, 36 pA; a tlak v komoře, ~ 7 × 10-5 Pa.
snímky EDX byly pořízeny přístrojem Zeiss Ultra Plus. Rentgenové mapy a spektra byly pořízeny rentgenovým detektorem X-MaxN 80 (Oxford Instruments, UK). Parametry EDX byly následující: urychlovací napětí, 10 kV; proud sondy, 300 pA; pracovní vzdálenost, 8,5 mm; a doba zpracování, 4 .
Přímé oxidační aktivitu obvazy
generování ROS v buňce-bez podmínek byla hodnocena pomocí 3,3′,5,5′-tetramethyl-benzidin (TMB), jako substrát pro křenovou peroxidázou (HRP). Kruhy o průměru 6 mm byly vyříznuty z obvazů a testovány. Krátce, pracovní roztok se skládala z 0,1 mg/mL TMB (zásobní roztok, c = 1 mg/mL v DMSO), ve směsi 1:9 s 0,05 M citrát–fosfátový pufr (pH = 5) a HRP (finální c = 0.16 IU/mL). Každý kus obvazu byl ponořen do 0, 5 mL pracovního roztoku a vzorky (25 µL)byly odebrány za 0, 5, 7, 5 a 10 minut. Ihned po odběru se vzorky byly smíchány v poměru 1:1 s na 0,16 M H2SO4 a absorbance byla přečtena při 450 nm (referenční vlnová délka = 540 nm), za použití NanoDrop OneC nástroje (ThermoFisher Scientific, USA). 30% H2O2 bylo použito jako pozitivní kontrola. Signál pozadí (prázdné řešení) byl odečten.
pronikání stříbra do deepitelizované kůže
pro zkoumání pronikání stříbra do deepitelizované kůže jsme použili statické difuzní Franzovy buňky. Kůže byla získána z místních jatek (Bocus, Letohrad, Česká republika) a vyříznuta z vnitřní části prasečího ušního boltce. Vlasy, byl oholený, kůže byla inkubována v PBS (60 °C, 90 s), a epidermis bylo oloupané. Průměrná tloušťka de-epithelized kůže byla 2 mm. Kůže kusy byly umístěny do komory a pokryty testované stříbrné obvazem nebo kus gázy. Každá dárcovská komora byla naplněna 0, 3 mL kultivačního média NHDF s 10% FBS. Akceptorová komora obsahovala 0,7 mL kultivačního média. Difuzní buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu 24 nebo 48 hodin. Po inkubaci, kůže byla opláchnuty PBS, a některých částech kůže, která oddělovala donor a akceptor komory byly analyzovány na obsah stříbra pomocí ICP-OES, jak je popsáno výše. Množství stříbra, které proniklo deepitelizovanou kůží, bylo měřeno v donorové tekutině. V obou případech byly připraveny tři nezávislé repliky.
Kultivaci ex vivo kůže s obvazy
Čerstvé (1-2 h) prasečího boltce (Bocus) byly důsledně čistit s mýdlem a Betadine (POVIDON jód řešení, Egis Pharma, Maďarsko) a opláchnout vodou. Kůže kousky (1 × 1 cm) z boltce byl vyříznut a umístěn do roztoku antibiotik (penicilin–streptomycin řešení, 10 000 U/mL penicilinu, 10 mg/mL streptomycin) po dobu 30 min při 37 °C za atmosférického O2 a CO2. Vzorky kůže s neporušenou epidermis byly umístěny dermální stranou směrem nahoru v 6-no kultivační desky s 3 mL NHDF střední doplněno 10% FBS a pak pokryta 1 × 1 cm vybrané stříbrné obsahující obvaz nebo sterilní kontrola gázou namočenou s 300 µl kultivační médium. Vzorky byly inkubovány po dobu 24 nebo 48 hodin. Poté, kůže byla opláchnuta PBS a každý z kožních explantátů byl rozdělen na třetiny pro histologické vyšetření (4% PFA fixace na 4 °C), analýzy proteinů pomocí Western blot (snap zmrazení tekutým dusíkem), a qPCR (přes noc v roztoku RNAlater (Thermo Fisher Scientific), pak při teplotě − 80 °C).
histologické barvení
autometallogické barvení stříbra bylo přijato podle Danschera et al.49. Snímky byly pořízeny pomocí mikroskopu Eclipse 50i s připojenou kamerou DS-Fi1 (Nikon, Yokohama-Shi, Japonsko).
Pro imunofluorescenční z yH2AX, histologických řezech na Superfrost Plus sklíčka (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) byly deparaffinized a inkubovány přes noc s primární protilátkou (1:1000, a ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, klon JBW301, Millipore, MA, USA). Ty pak byly inkubovány po dobu 1 hod se sekundární protilátkou (ab150114, Abcam, Cambridge, UK; ředění 1:10 000) a namontovat na snímky s Prodloužit Diamond Antifade Krycí s DAPI (ThermoFisher Scientific). Snímky byly pořízeny fluorescenčním mikroskopem Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japonsko).
genová exprese
prasečí kůže po inkubaci s obvazy byla zpracována pro izolaci RNA, syntézu cDNA a expresi genu qPCR, jak bylo popsáno dříve Klein et al.50 TaqMan Real-Time PCR Testy (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) použité pro qPCR byly: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. Hodnoty prahového cyklu byly normalizovány na gen úklidu RPL13A a vztaženy k kontrolním vzorkům gázy pro konkrétní čas (interval 24 – nebo 48-h) metodou 2−Δδct51. Bylo změřeno a zprůměrováno šest nezávislých vzorků pro každé ošetření a čas. Význam rozdílů v genové expresi ve vztahu k kontrole gázy byl hodnocen pomocí Studentova t-testu pro každý stříbrný obvaz ve stanoveném čase.
Western blotting
pro následnou analýzu Western blot byly tkáňové lyzáty připraveny ze zmrazené kůže prasat. Použití skalpelu v kapce lyzačního pufru (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% deoxycholát sodný; 1% dodecylsulfát sodný; 4% močoviny), byla kůže nakrájíme na malé kousky, které byly následně homogenizovány v 350 µl lyzačního pufru za použití nerezové oceli, 5 mm korálek a tkáňového homogenizátoru (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Německo) po dobu 10 min při 25 Hz. Koncentrace proteinu byla měřena pomocí BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific).
Proteiny v lyzáty byly odděleny pomocí 4-15% gradient SDS-PAGE a přeneseny na polyvinylidene difluoride membrány. Pro detekci specifických proteinů byly membrány inkubovány přes noc v blokujícím pufru (20 mM Tris; 137 mM NaCl; 0,05% Tween 20; 5% sušeného nízkotučného sušeného mléka) s primární protilátkou fosfo-Histon H2A.X (20E3) (1:1 000; buněčná signalizace, US). β-aktin byl použit jako Kontrola zatížení množství bílkovin (1: 2000; Santa Cruz, USA). Membrány byly vyvinuty s HRP konjugovaným anti-králíkem nebo anti-myším Ig pomocí chemiluminiscenční detekce pro vizualizaci signálů (Clarity Western ECL substrát; Bio-Rad, US). Signály byly skenovány a vyhodnoceny pomocí Alliance 9.7 Chroma chemiluminiscence Imaging System (UVItec Limited, UK).
antibakteriální aktivita
k porovnání antimikrobiálních aktivit obvazů byla použita metoda difúze agaru. Vzorek kus (1 cm2) každý obvaz byl inkubován na čerstvě naočkované Petriho misky s buď Staphylococcus aureus nebo Pseudomonas aeruginosa; tyto kmeny byly izolovány z lidských chronických ran, charakterizovat a kultivovány, jak je popsáno previously52. Dále byla porovnána antimikrobiální účinnost obvazových extraktů (připravených v RPMI médiu s 10% FBS, jak je popsáno výše) metodou mikrodiluce53. Optická hustota byla měřena Ensight Multimodální plate reader (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) při 600 nm po dobu 24 h (třepání, 37 °C).
buněčná kultura
normální lidské dermální fibroblasty z dospělé kůže (NHDF) byly zakoupeny od společnosti Lonza (Basilej, Švýcarsko). NHDF byly kultivovány v Dulbecco ‚ s modified Eagles nízké glukózy v médiu (DMEM) s přídavkem 10% FBS, glutamin (0,3 mg/mL), glukózy (4 mg/mL), penicilin (100 jednotek/mL) a streptomycin (0,1 mg/mL) v 75 cm2 kultivační baňky pod 5% CO2 a 37 °C až do páté pasáže. HaCaT keratinocyty byly zakoupeny od Hölzelová Diagnostika (Köln, Německo) a byly kultivovány stejným způsobem, ale bez přídavku glukózy do média.
měření Životaschopnosti
Pět tisíc buněk na jamku byly nasazeny v 96jamkové destičky s 200 µL kultivačního média s 10% FBS v inkubátoru (37 °C, 5% CO2) přes noc. Následující den byly buňky ošetřeny 200 µL ředicí řady extraktů z obvazů (100%, 50%, 20%, nebo 10% původního extraktu zředěného kultivačním médiem doplněným 10% FBS) po dobu 24, 48 a 72 hodin. Kontrolní buňky byly ošetřeny standardním 10% kultivačním médiem FBS. Životaschopnost byla měřena tak, jak bylo popsáno dříve54 pomocí testu 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid (MTT). Do buněčného kultivačního média v každé jamce byl přidán zásobní roztok MTT (20 µL; c = 5 mg/mL). Destičky byly inkubovány po dobu 2,5 h při 37 °C. Poté, MTT roztok byl odstraněn, 220 µL lyzačního roztoku (1:1 propan-2-ol s DMSO, 10% (w/v) Triton X-100 a 0,37% (w/v) HCl) bylo přidáno, a lýza byla prováděna po dobu 30 min při pokojové teplotě na třepačce (150 rpm). Absorbance byla čtena při 570 a 690 nm pomocí čtečky Multimodových desek EnSight (PerkinElmer, USA). Údaje byly zpracovány v Kaleido (PerkinElmer, USA). Konečná absorbance byla vypočtena jako A = A570 – A690. Změna životaschopnosti léčených buněk vzhledem k kontrolním buňkám byla vypočtena jako změna = (vzorek / kontrola-1) × 100.
Přímý kontakt test inhibice
Buňky byly nasazeny v hustotě 300 000 buněk na jamku v 6-no deska a inkubovány v kultivačním médiu doplněném 10% FBS při 37 °C a pod 5% CO2, dokud soutoku bylo dosaženo. Obvazy byly nakrájíme na čtverečky 1 cm2, které na buněčné vrstvy, a inkubují se standardním kultivačním médiu po dobu 6 h. Kontrolní buňky byly léčeny pouze médium. Poté byly buňky promyty PBS a fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 15 minut. Buňky byly obarveny s 0,1% (w/v) roztoku krystalové violeti (rozpuštěn v 10% ethanolu) na hodinu, a pak opláchnuty vodou. Inhibiční zóny byly fotografovány pomocí digitálního fotoaparátu Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f (Canon).
Fluorescenční barvení buněk
Pro poškození DNA analýzy, NHDF buňky byly nasazeny na mikroskopická sklíčka do 6-deska s hustotou 2 × 105 na jamku a nechá se držet přes noc. Na následující den, buňky byly ošetřeny s 5 × zředěný oblékání extrakty a inkubovány po dobu 24 h. Následně, buňky byly fixovány pomocí 4% PFA po dobu 15 min. Po permeabilisation a blokování, snímky byly inkubovány s anti-yH2AX králičí primární protilátce (Cell Signaling, US; 1:500 ředění v blokačním pufru—20% FBS, 0,3 M glycin, 0.05% Tween 20 v PBS; přes noc, 4 °C). Detekce byla provedena pomocí sekundární protilátky označené Alexou Fluor 555 (Abcam, UK; 1: 500 v blokujícím pufru; 1 h, RT). Sklíčka byla namontována pomocí ProLong Diamond Antifade Mountant s Dapi (ThermoFisher Scientific). Po vysušení snímků byly snímky pořízeny pomocí fluorescenčního mikroskopu Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japonsko).
intracelulární oxidační stres byl detekován pomocí sondy DCF-DA, která je citlivá na celkovou koncentraci ROS uvnitř buněk. Buňky byly nasazeny přes noc v 24jamkové destičce a pak označeny DCF-DA (1 µg/mL) po dobu 15 min, po kterém oni byli léčeni s 5 × zředěný oblékání extrakty a inkubovány při 37 °C a pod 5% CO2. 5 mM H2O2 byl použit jako pozitivní kontrola. Zelená fluorescence DCF byla zaznamenána každých 15 minut během 90 minut inkubace pomocí automatizovaného mikroskopu Incucyte S3 (Essen Bioscience, USA). Kvantifikace intracelulární fluorescence byla provedena v softwaru Fidži podle metody popsané v Čepa55.
Stanovení oxidační praskla neutrofily v krvi
nezávislé etické komise schválila odběr pro neutrofilů oxidační burst test a MAT (Etická komise pro Výzkum Masarykovy University, Brno, Czechia, schválení ne. EKV-2018-083). Všichni dárci dali svůj písemný souhlas.
oxidativní výbuch (produkce ROS) krevní fagocyty byla stanovena ve zředěné krve pomocí luminolu-enhanced chemiluminiscence (CL) pomocí LM-01T mikrodestičky luminometru (Immunotech, česká Republika). Krátce, reakční směs se skládala z 6 µL plné krve v 54 µl RPMI-1640 růstové médium smíchané s 60 µl oblékání extrakt ve fyziologickém roztoku nebo FBS-obohaceném médiu. Tato směs byla inkubována při 37 °C po dobu 20 minut. Těsně před začátkem měření jsme přidali 1 mM luminol (zásobní roztok 10 mM luminolu v 0,2 M pufru boritanu) (Molecular Probes, USA). Zjistili jsme, spontánní produkce ROS a ROS produkce vyvolané opsonised zymosan částice (OZP—0,1 mg/mL) (Sigma-Aldrich, USA) nebo phorbol 12-myristate 13-acetát (PMA—0,8 µM; Sigma-Aldrich, USA). Neošetřené vzorky bez testovaných extraktů byly vyhodnoceny jako kontroly. Testy byly provedeny v duplikátech. Chemiluminiscence byla zaznamenána nepřetržitě po dobu 90 minut při 37 °C a byla vyjádřena jako relativní světelné jednotky (RLU). Stanovili jsme celkové množství produkce ROS z integrované oblasti pod chemiluminiscenční křivkou.
test aktivace monocytů (MAT)
MAT byl proveden v 10 × heparinizované lidské plné krvi zředěné fyziologickým roztokem. Vzorky krve byly odebrány od pěti zdravých dárců, sloučeny a zředěny fyziologickým roztokem. Zředěné vzorky krve byly inkubovány s 6 mm-průměr kruhů řez od obvazy ve sterilních mikrozkumavek po dobu 24 h při teplotě 37 °C paralelně, lipopolysacharid (LPS, finále c = 0. 25 IU/mL; Endotoxin Standard E-Toxate; Sigma, USA) bylo přidáno do druhé série vzorků inkubovaných s dresinkem vzorky stimulovat vrozenou imunitní odpověď na bakterie. Krevní buňky se během inkubace sedimentovaly a zanechaly horní fázi plazmy zředěné fyziologickým roztokem. Po inkubaci, 200 µL každého fyziologického roztoku zředěné plasmy byl vzorek odebrán a okamžitě testovány v duplikátů pro IL-6 pomocí IL-6 Lidské Nenatíraný ELISA Kit podle výrobce je protokol (ThermoFisher Scientific, USA). Absorbance byla přečtena pomocí EnSight Multimodální Plate Reader (PerkinElmer, USA) a poslední IL-6 koncentrace byla vypočtena podle Kaleido SW (Perkin Elmer, USA). Zbývající plazmatické a sedimentované buňky byly uchovávány při teplotě 4 °C pro hodnocení hemolýzy a toxicity.
hemolýza
hemolýza byla detekována ve zbývající plazmě zředěné fyziologickým roztokem a sedimentovaných buňkách z MAT. Po centrifugaci bylo 100 µL každého vzorku přeneseno na 96jamkovou mikrodestičku a absorbance byla měřena při 550 nm. 1% Triton X-100 byl použit jako pozitivní kontrola.
uvolňování LDH
toxicita stříbrných obvazů do krevních buněk byla hodnocena pomocí testu laktátdehydrogenázy (LDH) (cytotoxicita Detection KitPLUS, Roche, Švýcarsko) podle pokynů výrobce. Byly použity dva zdroje krevních buněk-lidská plná krev inkubovaná stříbrnými obvazy jako v MAT a izolované neutrofily. Absorbance použitá pro korekci pozadí byla měřena v prázdných vzorcích bez činidla LDH. Výsledky jsou uvedeny jako absolutní hodnoty optické hustoty ve srovnání s neošetřeným vzorkem.
Statistická analýza
Pokud není uvedeno jinak, byl studentský t-test použit k vyhodnocení statistické významnosti rozdílů mezi vzorky a neošetřenými kontrolami.