váš poradce vám řekne, že chce, abyste použili HPLC k analýze vaší sloučeniny. Víte, že jste o této technice už slyšeli, ale nemůžete si vzpomenout, co HPLC znamená, natož jak to udělat! Všichni jsme tam byli, a vsadím se, že si přejete, abyste v té přednášce věnovali více pozornosti!
nebojte se – v této sérii článků bych vám připomenout, o sílu HPLC kolony 🙂
V tomto prvním článku se budu vás provede princip HPLC a připomene vám jeho použití – budete připraveni pro laboratoře v žádném okamžiku!
jak přípravek HPLC působí?
vysoce výkonná kapalinová chromatografie neboli HPLC je dlouhý název pro výkonnou techniku založenou na prostém faktu, že jednotlivé sloučeniny se ve vodě chovají odlišně.
HPLC odděluje a čistí sloučeniny podle jejich polarity, nebo jejich tendence líbí nebo nelíbí vody. Chcete-li dát polaritu do kontextu, zvažte, že olej je nepolární kapalina, která se nemísí s vodou. Ethanol je naproti tomu polární a jak mnozí z vás vědí, velmi dobře se mísí s vodou (Vodka a koks někdo??).
snažil jsem se zjednodušit celý proces na obrázku 1 níže, ale nejprve se podívejme na hlavní komponenty zapojené do HPLC. Předem se omlouvám za nějaký nevyhnutelný žargon!
komponenty
sloupec HPLC
Toto je také známé jako stacionární fáze. Jedná se o pracovní kůň stroje HPLC, je vyroben z jedné z různých látek (často oxidu křemičitého) a má velmi kompaktní povahu. Částice oxidu křemičitého jsou funkcionalizovány dlouhými uhlíkovými řetězci. Uhlíkové řetězce jsou nepolární, a proto čím delší je řetězec, tím více se sloup stává. Kolony obsahující 18-uhlíkové řetězce se běžně používají a jsou známé jako kolony C18.
typy vzorků HPLC
se velmi liší v závislosti na poli a typu dotyčných sloučenin. HPLC lze použít k analýze sloučenin v biologických vzorcích (moč, krev, sliny a svaly), vzorky prostředí, léčivá chemie (léky) a mikrobiologie (toxiny produkované houbami a bakteriemi).
injekce vzorku
vzorky se vstřikují do kolony HPLC. To se dříve provádělo ručně, což znamená, že nějaká chudá duše musela sedět u stroje HPLC celé hodiny na konci vstřikování každého vzorku injekční stříkačkou, někdy celou noc!
naštěstí novější modely mají automatický vstřikovač, což snižuje ruční vstup a umožňuje vyšší propustnost. Moderní stroje jsou vybaveny softwarem, který umožňuje uživateli zadat seznam vzorků, kolik a v jakém pořadí by měly být injikovány. Takže si můžete vychutnat svůj oběd, zatímco vaše HPLC běží sám!
mobilní fáze
Toto je opravdu jen směs vody a organického rozpouštědla (obvykle acetonitril nebo methanol). Mobilní fáze jej pojmenuje, protože se pohybuje sloupcem a současně eluuje (nebo vyplavuje) sloučeniny ze sloupce.
sloučeniny se často eluují podél koncentračního gradientu. Pokud jste něco jako já, koncentrace a gradient jsou dvě slova, která nesnášíte, když se ve větě spojíte! Znamená to jen, že procento vody v mobilní fázi v průběhu času klesá, zatímco procento apolárního rozpouštědla se zvyšuje současně. To znamená, že mobilní fáze se postupně stává více nepolární. Nebojte se příliš mnoho o přechody pro tuto chvíli, jak se objeví znovu v navazujícím článku.
běh HPLC
HPLC lze provádět v několika režimech. Nejčastěji používaná metoda je známá jako reverzní fáze (RP-HPLC) a to je to, co zde popisuji. V tomto režimu jsou sloučeniny odděleny od nejpolárnějších a končících nepolárními sloučeninami. U všech režimů pohybuje vysoce výkonné čerpadlo vzorek a mobilní fázi sloupcem. Typický běh může trvat 10-60 minut.
princip za HPLC-bližší pohled
Nyní, když máte představu o zapojených součástech, přejdeme k principu trochu podrobněji.
výše jsem zmínil, že HPLC odděluje sloučeniny na základě polarity. Ale jak to vlastně funguje? Anglicky prosím! Jak gradient začíná, koncentrace rozpouštědla se zvyšuje, zatímco koncentrace vody klesá. Díky tomu je mobilní fáze stále více apolární. Sloučeniny obsažené ve vzorku se budou držet uhlíkových řetězců ve sloupci, přičemž nejvíce nepolární sloučeniny se lepí nejsilněji a nejvíce polární sloučeniny se slabě lepí.
Obrázek 1 ukazuje, co se stane se vzorkem obsahujícím směs sloučenin po injekci do kolony. Sloučenin vázat na sloupci a jsou zapsány v různých časech, v závislosti na tom, zda jsou více pravděpodobné, že držet sloupec nebo mobilní fáze je čerpána přes. Čas, který každá sloučenina eluuje (nebo vyplavuje) z kolony, je známý jako retenční čas této sloučeniny (Rf).
Obrázek 1: princip HPLC
Obrázek 1: Sloučenin lišící se polaritou (uvedeno jako tmavší odstíny modré) jsou injekčně do HPLC kolony (celý válec). Mobilní fáze je čerpána přes sloupce, a přidáním rozpouštědla podél koncentračního gradientu (znázorněno jako černá čárkovaná čára) neustále klesá celkový polarity mobilní fáze (Y-osa). Sloučeniny jsou schopny držet se kolony nebo mobilní fáze, v závislosti na tom, jak jsou polární. Sloučeniny se nakonec budou držet mobilní fáze, když jejich polarita odpovídá polaritě mobilní fáze. Poté se oddělí od sloupce a během běhu budou eluovány v určitém čase (osa X). Tato doba je známá jako Rf pro tuto sloučeninu.
pochopení výstupu
výstup nebo výsledky běhu HPLC se obvykle považují za chromatogram (Obrázek 2). Jedná se o horizontální řadu vrcholů představujících sloučeniny eluované ze sloupce s různými hodnotami Rf. Moderní zařízení HPLC je často spojeno s detektorem diodového pole (DAD), což umožňuje uživateli podívat se na výsledný chromatogram oddělených sloučenin ve vlnových délkách od 190 nm do 900 nm. Pokud jsou zkoumané sloučeniny známy, může se uživatel rozhodnout podívat se pouze na 1 nebo několik vybraných vlnových délek. Například kokain lze pozorovat při 254 nm.
Obrázek 2: typický HPLC chromatogram
Obrázek 2: Tento chromatogram ukazuje separaci sloučenin z chemické reakce, a chromatogramu je zobrazeno na 254 nm. Dva hlavní vrcholy se vyskytují v 8.20 a 9 minut, což představuje dvě sloučeniny s těmito retenční časy. Počet absorpčních jednotek (AU) je zobrazen na ose Y, zatímco čas běhu je zobrazen na ose X.
Aplikace
V biologii a medicíně, HPLC je často používán jako analytický nástroj k analýze biologických vzorků a vzorků z prostředí na přítomnost nebo nepřítomnost známých sloučenin (například metabolity, léky, toxiny, pesticidy), a mohou pomoci při identifikaci neznámých sloučenin.
v chemii se však HPLC běžně používá ke sledování chemických reakcí a ke stanovení čistoty produktů. Kromě toho může být proces HPLC modifikován na preparativní HPLC, přičemž zajímavé sloučeniny mohou být čištěny pro další použití.
HPLC může narazit jako velmi složité, ale buďte ujištěni, stejně jako většina ostatních laboratorní techniky, to dělá mnohem větší smysl, když jste vlastně dělat.
Zůstaňte naladěni na mé navazující články v nadcházejících týdnech, ve které jsem se projít pár rad, jak se můžete dostat to nejlepší z vašeho HPLC spustit v závislosti na vašem výzkumný cíl, stejně jako diskutovat objektivně, jak HPLC může být použita ve vašem výzkumu.
existují nějaké další aspekty této techniky, které byste chtěli podrobněji popsat? Pokud ano, rádi bychom od vás slyšeli!
Happy HPLC-ing 🙂
pomohlo vám to? Pak prosím sdílejte s vaší sítí.