Úvod
Kcat je obrat, počet-počet molekula substrátu každý enzym stránky konvertuje k produktu za jednotku času. Pokud znáte koncentraci enzymových míst, můžete při analýze křivky substrátu vs. rychlosti umístit Kcat místo Vmax.
model
Y = Et*kcat*X/(Km + X)
“ X “ je koncentrace substrátu.
Y je rychlost enzymu.
kcat je číslo obratu, kolikrát každé místo enzymu převádí substrát na produkt za jednotku času. To je vyjádřeno inverzí časových jednotek osy Y. Pro příklad, když Y je v mikromolu substrátu za minutu, pak kcat je počet molekul substrátu vyrobeného na katalytické místo za minutu.
Km je Michaelis-Menten konstantní, ve stejných jednotkách jako X je koncentrace substrátu potřebné pro dosažení poloviny maximální enzymu rychlost.
Et je koncentrace enzymových katalytických míst. Pokud má enzym více podjednotek, všimněte si, že Et je koncentrace katalytických míst, která může být větší než koncentrace enzymových molekul. Hodnoty Y, které zadáte, jsou rychlost enzymu zadaná v jednotkách koncentrace za čas. Et musí být zapsáno do stejných koncentračních jednotek (zatímco časové jednotky jsou definovány kcat).
vmax je maximální rychlost enzymu ve stejných jednotkách jako Y. ve výše uvedeném modelu není přímo ukázána. To je rychlost enzymové extrapolovat na velmi vysokých koncentracích substrátu, takže je téměř vždy vyšší než rychlost naměřená v experimentu. Vypočítá se vynásobením Et krát kcat.
vztah k Michaelis-Mentenovu modelu
výše uvedená křivka je totožná s křivkou definovanou Michaelisovým-Mentenovým modelem. Získáte identické křivky, když se vejde jeden model do vašich dat, a stejné hodnoty Pro Km.
Michaelis-Menten model najde Vmax, což je maximální enzymu rychlost extrapolovat z velmi vysokých koncentracích substrátu. Vyjadřuje se ve stejných jednotkách, jaké jste použili při zadávání hodnot Y (enzymová aktivita). Obvykle je jednoduché vyjádřit tento (nebo převést na ) krtky/minutu/mg proteinu. Vmax se určuje podle toho, kolik enzymových míst je přítomno (Et) a rychlosti, jakou může enzym převést substrát na produkt (Kcat).
Pokud znáte koncentraci enzymových míst, která jste přidali do testu (Et), můžete použít katalytickou konstantu Kcat pomocí výše uvedeného modelu.
při výpočtu kcat se koncentrační jednotky vyruší, takže Kcat je vyjádřena v jednotkách inverzního času. Je to číslo obratu-počet molekul substrátu, které každé místo enzymu převádí na produkt za jednotku času.
montáž modelu Prism
1.Vytvořte datovou tabulku XY. Zadejte koncentraci substrátu do X a rychlost enzymu do Y. pokud máte několik experimentálních podmínek, umístěte první do sloupce a, druhý do sloupce B atd. Můžete si také vybrat ukázková data Prism: enzymová kinetika-Michaelis-Menten.
2.Po zadání dat klikněte na analyzovat, vyberte nelineární regresi, vyberte panel rovnic kinetiky enzymů a vyberte Kcat.
3.Musíte omezit Et na konstantní hodnotu na základě jiných experimentů. Omezit hodnota Et, přejděte na Omezit na kartě nelineární regrese dialogové okno, ujistěte se, že rozbalovací další na Et je nastavena na „Konstantní rovno“ a zadejte hodnotu. Pro vzorová data zadejte 100 jako hodnotu Et.
Pokud nevíte hodnota Et, nemůžete se vešly kcat, ale místo toho by měla odpovídat Vmax. Není možné, aby se Prism přizpůsobil jak kcat, tak Et, protože oba parametry jsou vzájemně propojeny, a křivka rychlosti substrátu neposkytuje žádné informace o jejich jednotlivých hodnotách.
4.S ukázkovými daty Prism uvádí, že Km= 5.886 s 95% intervalem spolehlivosti v rozmezí od 3.933 do 7.839. Nejlepší fit hodnota kcat je 13.53 s 95% intervalem spolehlivosti v rozmezí od 11.97 do 15.09.
poznámky
* viz seznam předpokladů všech analýz kinetiky enzymů.
* tato rovnice odpovídá přesně stejné křivce jako rovnice, která odpovídá Vmax, spíše než číslo obratu Kcat. Produkt kcat times Et (koncentrace enzymových míst) se rovná Vmax.
* tato rovnice souvisí s rovnicí pro alosterické enzymy. Tento allosterický model přidává další parametr: sklon kopce h. když se h rovná 1,0, jsou oba modely identické.