Identifikace útlum a antitermination nařízení v prokaryot

Charakteristika tlumiče v B. subtilis a E. coli

rozsáhlé literatury vyhledávání pro operons v B. subtilis řídí útlum nebo antitermination byla provedena a 46 takové operons byly nalezeny. Ty se pohybují od experimentálně dobře popsáno trp operon pro ty, operons, kde terminator struktury byly nalezeny a útlum se očekává, že když není dobře, vyznačující se experimentálně (pro úplný seznam viz http://www.bork.embl-heidelberg.de/Docu/attenuation). Tyto 46 známé Terminátor struktury byly použity ke stanovení společných charakteristik B. subtilis útlumu terminátory. Pomocí těchto charakteristik jsme promítali upstreamové oblasti genů 3650 B. subtilis (pomocí postupů popsaných v materiálech a metodách) pro záhyby terminátorů. Čtyřicet tři z originálu 46 známé terminátory nalezené při hledání literatury byly zachovány v tomto screeningu. Bylo také získáno dalších 1117 záhybů proti proudu, které odpovídají našim kritériím. Kromě toho, jako kontrolu jsme použili stejné filtrování a skládací metodiky na intergenic regionů po sekvencí byly zamíchány náhodně (952 záhyby náhodně zamíchány sekvence byly získány po filtrování).

výsledné záhyby všech intergenic regionů a šoural sekvence získané po filtraci byly vyneseny z hlediska jejich stability a délky (viz Obrázek 1). Známé záhyby terminátoru leží v shluku jasně odděleném a odlišném od těch záhybů náhodně zamíchaných sekvencí. Záhyby terminátoru mají menší volnou energii (ΔG) ve vztahu k délce než předpokládané záhyby náhodných sekvencí. Podobný vzor se dva snadno oddělit shluky se objevuje při porovnávání známý terminator struktur se sepjatýma intragenic regionech, v nichž terminator nejsou očekává, že bude zjištěno (údaje nejsou uvedeny).

Pomocí principal component analysis, jsme zjistili největší rozptyl náhodně zamíchány sekvence. To nám může poskytnout míru (pomocí směrodatné odchylky), jejíž záhyby se výrazně liší od záhybů náhodných sekvencí (viz materiály a metody). Z 1160 záhybů spadá celkem 203 záhybů mezigenních oblastí získaných na naší obrazovce pod 2. odchylku (Z ≤ -2) odvozenou od hlavní složky. Ty jsou tedy považovány za významně odlišné od náhodných záhybů a možných zakončení místa útlumu nebo antiterminační regulace. Čtyřicet dva z nich jsou známé záhyby zakončení útlumu (z původních 43 známých záhybů udržovaných po filtraci). Tím jsme schopni získat 91.3% (42/46) známé a experimentálně charakterizována útlumem a antitermination stránky, pomocí našeho filtru a významu opatření. Navíc filtr a významnost měří obrazovky přes 97,7% (930 z 952) záhybů náhodných sekvencí. Sto šedesát jedna (203 celkem s výjimkou 42 známý) záhyby pod čarou (Z ≤ -2) jsou záhyby dosud analyzovány experimentálně a může být, předpokládá se, že útlum terminator struktur.

podrobné šetření zjistilo, že mnoho z těchto předpovědí jsou silně podporovány jako domnělý útlum nebo antitermination stránek pomocí genomické kontextu, jako přítomnost domnělého promotoru sekvence, proti proudu umístění domnělé a známé operons, atd. Dvě Terminátor struktury upstream geny ydbJ a yqhI slouží jako podrobné příklady toho, jak genomické kontext může informovat a silně podporovat předpovědi provedené v tabulce 1 (Obrázek 2). Gen ydbJ B. subtilis je uveden jako hypotetický s homologií k transportnímu genu ABC (protein vázající ATP zapojený do transportu mědi). Gen bezprostředně po proudu, ydbK, má homologii k prostupům membrány. Pomocí STRING (nástroj pro vyhledávání najít opakující se případy sousedních genů ), orthologs tyto dva geny se nacházejí také ve stejném pořadí, v transkripční jednotky o dalších 15 vzdáleně příbuzné genomy, což naznačuje možnost tyto geny vytvořily operon. Zdá se, že tyto geny jsou v typické konfiguraci operonu ABC transportéru a je známo, že několik operonu ABC transportéru je regulováno útlumem v B .subtilis. Na ydbJ upstream region má také domnělého promotoru pořadí a předpokládané záhyby pomocí RNAfold (Viz Materiály a Metody) z celé upstream sekvence naznačují, že lze složit do složitých možné antitermination záhyby (údaje nejsou uvedeny). Na základě tohoto kontextu předpokládáme, že se jedná o operon ABC transportéru regulovaný útlumem. Druhý příklad, yqhI, je první gen běhu tří genů, které mají homologii s geny biosyntézy glycinu v domnělé transkripční jednotce. Tento běh tří genů má také ortology nalezené jako sousedé v jiných genomech . Mnoho operony biosyntézy aminokyselin v B. subtilis je známo, že jsou regulovány útlumem, čímž podporuje tuto předpověď.

aby bylo vidět, jestli pozorované vzory držet za pouze další genomu, ve kterém útlum nebo antitermination je dobře studoval a experimentálně popsán, jsme také použita stejná metodika rozvinutých regionů genů v E. coli genomu, pro které 16 operons byly popsány jako regulovaný útlum nebo antitermination. Jak je vidět na obrázku 3, známé struktury útlumu a antitermace E. coli mají podobné vlastnosti jako struktury B.subtilis. Po filtraci bylo zachováno 15 ze 16 známých atenuátorů. Míra významnosti odděluje 14 těchto terminátorů E. coli od náhodných záhybů, jak je vidět na obrázku 3. Stejně jako v B. subtilis, pomocí čáry (z≤-2) jako měřítka významnosti jsme schopni předpovědět útlum pro 146 oblastí (obrázek 3 a Tabulka 2).

Rozšíření analýzy na 26 genomů

Analýza B. subtilis a E. coli naznačují, že širší průzkum bakteriálních genomů může být užitečné v predikci útlumu a antitermination nařízení v těchto genomů a charakterizující vývoj a distribuce těchto mechanismů regulace. Pro tento průzkum bylo vybráno dvacet čtyři dokončených genomů na základě jejich široké distribuce napříč evolučním spektrem (Tabulka 3). Mezigenní oblasti každého z těchto genomů byly analyzovány stejnými metodami a filtry jako u B. subtilis a e. coli a předpokládaný útlum a antitermace Terminátor záhyby podobně získané.

Jak je uvedeno v Tabulce 3, je široké rozložení počtu domnělé útlum a antitermination regulačních míst v průzkumu genomů. Ty se pohybují od 5 u Mycobacterium tuberculosis do 275 u Clostridium acetobutylicum (Tabulka 3). Dřívější pokusy předpovědět standardní místa ukončení transkripce na konci transkripčních jednotek dávají podobné výsledky. Zajímavé je, že výsledky pro standardní transkripční terminátory korelují s našimi. Jak bylo zjištěno v Ermolaeva et. al s standardní terminátory na konci transkripční jednotky (tento papír, studoval terminátory na konci Orf a ne cíl těžební regiony, tedy filtrování možné, tlumiče), některé nejvyšší počet výskytů útlum a antitermination stránek v našem průzkumu jsou podobně nalezené v genomech E. coli, H. influenze, D. radiodurans a B. subtilis a nejnižší počet výskytů v těchto genomů jako H. pylori, a M. tuberculosis (genomy hlášeny v jejich průzkumu).

Na první pohled se zdá, naznačují, že mnoho genomů nepoužívejte stejné mechanismy pro ukončení standardní transkripce ukončení a nepoužívejte útlum nebo antitermination v nařízení. To je pravděpodobně případ některých genomů. Přesto, pokud je počet upstream mezigenních oblastí vynesen proti počtu předpokládaných lokalit, je zobrazena silná pozitivní korelace (obrázek 4). Menší počet genů a intergenic oblastí genomu má nižší výskyt předpokládané zakončení (jak standardní transkripční terminátory a útlum/antitermination regulační terminátory). To znamená, že nízké počty standardní ukončení a regulační ukončení v mnoha genomů je vzhledem k mnohem menší velikosti genomu a snížení počtu regulačních operons, a ne nutně v závislosti na různé mechanismy ukončení a nařízení.

Tam je jasné, outlier s mnohem nižší, než se očekávalo počet domnělé terminátory vidět na Obrázku 4, Mycobacterium tuberculosis. Tento genom má mnohem nižší výskyt domnělé útlum a antitermination míst, než by navrhl jeho velikost a počet intergenic regionů. Nedávný článek Unniraman et al. dochází k závěru, že M. tuberculosis používá jiný mechanismus ukončení, který využívá terminator struktur bez poly-U ocas nutné v jiných genomů. Snížený počet terminátorových struktur obsahujících Poly-U ve vztahu k počtu mezigenních oblastí lze tedy vysvětlit závislostí m.tuberculosis na jiném mechanismu ukončení. To nemusí nutně prokázat, že u m. tuberculosis neexistuje regulace typu útlumu nebo antitermace. Nicméně to naznačuje, že buď ztrátou standardní mechanismus ukončení v tomto genom má snížit, pokud ne eliminovat útlum nebo antitermination v M. tuberculosis, nebo alternativně, útlum-jako mechanismus by mohl existovat v tomto genomu, který využívá M. tuberkulóza nestandardní Terminátor.

všechny ostatní z 25 zkoumaných genomů mají předpokládané útlum nebo antiterminační regulační místa. I nejnižší počet předpověděl, útlum nebo antitermination lokalit v M. genitalium jsou významný podíl možných regulačních intergenic regionů, nízký počet je snadno připadá na tento genom je relativně malá velikost a několik intergenic regionů a transkripční jednotky. Tyto výsledky naznačují, že regulace útlumu a antitermace je možná všudypřítomným mechanismem regulace u prokaryot až na několik výjimek.

Velikost Genomu a Útlum

Pokud GC obsah genomu je ve srovnání s počtem předpověděl, útlumové články založené na náhodně zamíchány sekvence, GC obsah se poněkud korelovat s počtem předpověděl, útlumové články, které by se dalo očekávat od poly-U běhu je nutné v filtry. Obrázek 5a, záhyby z náhodně zamíchány intergenic sekvence 26 genomy byly vyneseny podle počtu filtrované záhyby na intergenic regionu ve vztahu k počtu intergenic regionů. Pokud byl počet filtrovaných záhybů zcela náhodný, měl by existovat relativně konstantní počet míst na region ve vztahu k počtu regionů. Jak je vidět na obrázku 5a, není tomu tak úplně. Počet filtrovaných záhybů na oblast získaný z náhodně zamíchaných sekvencí závisí na obsahu GC genomu. Genomy s nízkým obsahem GC mají o něco vyšší počet záhybů na region než genomy s obsahem GC kolem 50% a genomy s vysokým obsahem GC mají mnohem nižší počet než oba. To se očekává z náhodných sekvencí filtrovaných pro struktury kmenových smyček obsahující Poly-U běhy.

I když se vezme v úvahu GC obsah M. tuberculosis, má snížený počet předpověděl, útlumové články, ve vztahu k ostatním high-GC genomů (Obrázek 5b). Ve skutečnosti, Obrázku 5b (předpokládaná tlumiče skutečných intergenic sekvence) ukazuje, že nejsilnější určitý počet předpověděl tlumiče za intergenic regionu není GC obsah, ale spíše velikost genomu (přesněji řečeno počet intergenic regionů). Obecně, ne jen dělat větší genomy mají větší absolutní počet předpověděl, útlumové články, ale mají větší výskyt předpověděl tlumiče na regionu. Pokud je obsah GC stejný ve dvou genomech, větší genom má větší pravděpodobnost, že bude mít vyšší počet předpokládaných atenuátorů na mezigenní oblast. Předchozí zprávy naznačují, podobné jevy v regulačních proteinů, velké genomy se zdají mít větší podíl z jejich celkového počtu genů, které kódují proteiny, které obsahují regulační motivy . Zajímavé je, že diskontování archobakterie a vysoké GC obsah genom, genom o 1500 intergenic regiony se zdá být hranice, kde četnost regulačních tlumiče zvyšuje v genomu.

Distribuce a Zachování Tlumiče u Gram pozitivní Bakterie

Sedm genomů gram-pozitivní bakterie (B. subtilis, B. halodurans, L. innocua, S. aureus, C. acetobutylicum, L. lactis, S. pneumoniae) byly analyzovány, aby zjistili, zda útlum zakončení jsou zachovány v přední části orthologs. Počet předpokládaných terminátorů útlumu pro geny, o nichž je známo, že jsou regulovány v B.subtilis a jejich ortologové v dalších šesti genomech, je uveden v tabulce 4. Genomy jsou řazeny podle fylogenetické vzdálenosti od B. subtilis vypočtená aminokyselinovými sekvencemi sdílených ortologů mezi těmito genomy. Nejblíže k B. subtilis je B. halodurans a v průměru počet substituce aminokyselin na místě je 0.238, a nejvíce vzdálený je S. pneumoniae a v průměru počet substituce aminokyselin na místě je plášť 0,422. Pro 42 geny uvedené v Tabulce 4, počet orthologs, které se nacházejí v jiných genomů se liší jen málo od genomu do genomu: nejvyšší a nejnižší čísla orthologs jsou 31 v L. lactis a 26 v S. aureus a C. acetobutylicum, resp. Je to hlavně proto, že těchto 42 genů nese některé základní funkce, jako je syntéza aminoacyl-tRNA. Na druhou stranu, počty předpokládaných struktur ukončení útlumu se významně liší: v B. halodurans, 22 ortologních genů předpovědělo struktury ukončení útlumu, zatímco pouze 4 ortologní geny mají předpovězené struktury v s. pneumoniae. To naznačuje, že nepřítomnost nebo přítomnost regulace útlumem je mnohem slabě zachována než přítomnost genu nebo operonů.

stejný trend platí pro předpokládaný útlum ukončení stavby jiné než ty známé (Tabulka 5). Tam jsou 105 orthologous gen skupiny, které mají alespoň jeden další genomu obsahující předpokládané zeslabení struktury proudu k orthologous gen. Omezení na ortology, kteří předpovídali atenuátory v B. subtilis (35 skupin), nejvyšší a nejnižší čísla sdílených orthologs genů známo, řídí útlum nebo antitermination v B. subtilis jsou 28 (L. innocua) a 18 (S. pneumoniae), resp. Počty předpokládaných struktur ukončení útlumu se však liší více. Zatímco tam jsou 13 genů se předpokládané struktury v B. halodurans, která je nejblíže k druhu B. subtilis mezi šesti gram-pozitivní bakterie, pouze 2 geny předpovídali struktur v S. pneumoniae.

Ačkoli tam je slabý zachování tlumiče jako celek, předpokládá útlum, ukončení struktury a pořadí jejich následný geny jsou zachovány pro některé skupiny genů. Jedním z takových příkladů je infC-rpml-rplT operon (obrázek 6a). V předcházející oblasti infC U S. pneumoniae se nepředpokládá žádná struktura ukončení útlumu (Tabulka 5). Bližší pohled na tuto oblast výbuchem odhalil, že N-terminál infC je předpovězen v 27 základny. Přidáním 27 bází do mezigenní oblasti v upstream jsme našli stabilní strukturu kmenové smyčky, která následovala Poly-u zbytky také v S. pneumoniae (obrázek 6b). I v tomto příkladu však existují značné rozdíly mezi druhy v relativní poloze struktur kmenových smyček a zachování sekvencí. Navíc i mezi fylogeneticky nejbližším párem, B. subtilis a B. halodurans, vzdálenosti od konce stonku na start kodonu z infC jsou 69 a 37 základny, respektive, a pouze společné segmenty nalezena ve stonku jsou GUGUGGGN{x}CCCACAC (x = 12 v B. subtilis a x = 9 v. B. halodurans). Mezi všemi sedmi genomy existuje pouze slabá podobnost, GYGGG (GACGG v C. acetobutylicum) v oblasti stonku.

Zachování předpokládá útlum, ukončení stavby je také pozorován v těžební regiony z možných operon obsahující nusA genu (Obrázek 7a). Čtyři ze sedmi genomů obsahují predikované atenuační struktury před hypotetickým proteinem (ylxS v B. subtilis). Struktury kmenových smyček se také nacházejí ve zbytku tří genomů, i když tyto struktury neprocházejí filtry. Umístění struktur do počátečního místa transkripce následného genu a samotných sekvencí se v tomto příkladu také významně liší. V těchto kmenových sekvence, segment GUGGG (GAGCG v L. lactis a GAGGC v S. pneumoniae) je zachována v předpokládané operon obsahující nusA genu (Obrázek 7b). Zajímavé je, že segmenty 5-báze jsou identické nebo velmi podobné segmentům ve strukturách kmenových smyček umístěných ve směru proti proudu infC (obrázek 6b). Proteiny kódované geny v těchto dvou operonech se podílejí na transkripci. Zachování pořadí segmentů v předpokládané zeslabení terminator struktury pro infC-rpmI-rplT operon a operon obsahující nusA znamená, že existuje společný regulační mechanismus, který rozpozná stem-loop struktury, a to by regulovat oba operons stejným způsobem.

Distribuce a Zachování Tlumiče v Proteobacteria

Několik aspektů ochrany tlumiče jsou okamžitě zřejmé z našeho rozboru gram-pozitivní bakterie . Za prvé, distribuce útlum nebo antitermination nařízení není dobře zachovaná přes gram-pozitivní baceria a navíc, i v zachovaných regulační systémy, sekvence a struktury ochrany přírody je slabá. Totéž platí pro proteobakterie. Ze 14 genů v e. coli (viz tabulka 5a), o níž je známo, že je regulována útlumem nebo antitermací, žádný z nich nepředpokládal atenuátory ve všech čtyřech dalších genomech proteobakterií. Šest z nich má atenuátory předpovídané ortology proti proudu alespoň v jednom z dalších čtyř genomů. Tři jsou geny, které mají ortology ve všech čtyřech dalších genomech, ale tyto nemají žádné předpovídané atenuátory. Zbývajících pět genů v E. coli nemá buď žádné známé ortology v jiném genomu, nebo ortologové mají skvrnitou distribuci a žádné předpokládané atenuátory. Bližší prohlídka ručně potvrzuje tento závěr. Tabulka 5b je seznam všech předpověděl tlumiče v každé z pěti genomů gama rozdělení proteobacteria, v němž podobný tlumič je předpověděl pro ortholog jiného genomu. Jak je uvedeno v této tabulce, útlum a antitermination se zdá být špatně konzervované jako mechanismus regulace v obdobné operons v proteobacterial genomů. Z celkového počtu 475 genů a jejich ortologů v těchto pěti genomech, které předpovídaly atenuátory, je pouze 36 sdíleno proti proudu ortologů dvou nebo více genomů(Tabulky 3 ,5a a 5b).

Předchozí výzkum týkající se konkrétních systémů, uvádí, že útlum a antitermination nařízení v některých operons v E. coli jsou jen mírně zachovány napříč gama rozdělení proteobacteria. Nařízení rpsJ operon a trpE a pheA operons E. coli bylo prokázáno, že mají děravou distribuce a slabě konzervované napříč proteobacteria. Jak je uvedeno v Tabulkách 2, 5a a 5b, se nám podařilo značně rozšířit tuto analýzu útlumu a antitermination většina těchto systémů v proteobacteria, a ukázaly, že to platí pro všechny známé útlum a antitermination regulační mechanismy v E. coli a další předpokládané mechanismy v další gama rozdělení genomů. Příklad je uveden na obrázku 8 zachování nízké sekvence atenuátorů a regulace. Na obrázku 8a je jeden z konzervovanějších atenuátorů zobrazen pro operon hisG. Tento operon a regulační mechanismus je dobře charakterizován U E. coli a naše analýza předpovídá podobné mechanismy regulace útlumu u v. cholerae a H. influenzae. Předpokládané tlumiče mají zachované poloze (přibližně 40-50 bp upstream start kodonu z hisG gen), a kmenové pořadí. I když okolní mezigenerační oblasti není možné sladit, v. cholerae a H. influenzae mají možné aminokyselinové vedoucí sekvence s řadou histidinů, které jsou charakteristické pro mechanismus regulace útlumu U E. coli. Předpokládané atenuátory nebyly nalezeny v dalších třech genomech probacteria subdivize gama P. aeruginosa, n. meningitidus a X. fastidiosa. V P. aeruginosa na intergenic regionu před hisG ortholog je pouze 17 bp v délce, v X náročný na orthologous gen překrývá s ORF proti proudu, a i když analogická. N. meningitidus intergenic regionu je dostatečné délky, ne atenuátor je předpověděl.