Identifikace Bordetella pertussis v Kriticky Nemocných Human Immunodeficiency Virus-Infikovaných Pacientů Přímým Genotypical Analýza Gram-Barevné Materiál a Diskriminace z B. holmesii Pomocí Unikátní recA Genu Restrikční Enzymové Stránky

identifikace bakterií z klinických vzorků se do značné míry provádí fenotypovou charakterizací po in vitro kultuře a mikroskopii. Ne neobvykle, nicméně, přímé Gram-barvené přípravky odhalují mnoho organismů, přesto kultury nedokáží prokázat patogen. To bylo ilustrováno v nedávném klinickém případě, kdy byl 48letý muž s AIDS přijat s plicní kokcidioidomykózou. Navzdory antifungální terapii se jeho stav nezlepšil. Vzorky sputa odhalily mnoho gramnegativních bacilů na přímé mikroskopii, ale žádné patogeny na kultuře. Kromě toho několik krevních kultur rostlo náročnými gramnegativními tyčemi, které nemohly být specifikovány konvenčními metodami.

rozhodli jsme se pokusit o identifikaci obou izolátů genotypickými metodami pomocí univerzálních oligonukleotidových primerů zaměřených na gen malé podjednotky rRNA (16S rRNA). Z respiračních vzorků však byly k dispozici pouze gramové snímky. Proto jsme vyvinuli novou metodu, ve které bakteriální DNA je obnovit přímo z Gram-barevného snímku. Diapozitivy byly gramodesky obarveny tradiční metodikou (12). Čiré skleněné sklíčko bylo potřeno vzorky a ošetřeno absolutním methanolem (Mallinckrodt, lískové dřevo, Mo.), následovaná tepelnou fixací při 65°C a ošetřením roztokem crystal violet (Remel, Lenexa, Kans.). Snímek byl dále léčen Gram je jód (Remel), odbarví s alkoholem-aceton roztok (3:1), a s kontrastním safranin (Remel). Ponorný olej byl nejprve odstraněn ze sklíčka 100% xylenem (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) a poté opláchnut 100% ethanolem. Poté byl materiál sešrotován rovnou žiletkou, suspendovanou v 50 µl hydratačního roztoku Puregene-DNA (Gentra, Minneapolis, Minn.), vortexed a vařil po dobu 10 minut. Pro analýzu izolátu krve byl použit materiál jak z láhve BACTEC, tak z kolonií pěstovaných na pevném médiu. Následné PCR byla provedena v objemu 50 µl obsahující 5 µl šablony, 1,5 mM MgCl2, 100 µM každého deoxynucleoside trifosfát (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind.), 1 U Taq DNA polymerázy (Roche Diagnostics Corporation), a 0,15 µM (každý) univerzální 16S rRNA primerů 11E (5′-GAGGAAGGTGGGGATGACG-3′) a 13B (5′-TCCGGGCCCTTGCATAAGTG-3′), jak je popsáno dříve (15). Po krok denaturace 5 min při 94°C, kroky PCR 94°C po dobu 60 s, 50°C po dobu 60 s a 72°C po dobu 90 s, byly opakované 30 krát v Perkin-Elmer GeneAmp PCR system 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie.). Produkty byly získány jak ze sputa, tak z krve (obr. 1). Ty byly čištěny pomocí qiaquick PCR purification kit (Qiagen Inc., Valencia, Kalif.) a sekvenování DNA bylo provedeno na aplikovaném Biosystems abi3100 sekvenceru (Hhmi Biopolymer / WM Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University School of Medicine). Následné srovnání s veřejnou databází (GenBank) pomocí BLAST (1) identifikovalo krevní izolát jako Helicobacter cinaedi nebo Helicobacter rappini. Oba organismy byly spojeny s bakterémiemi u imunokompromitovaných pacientů (9, 10, 13, 16, 17). PCR produkt dýchacích izolovat uzavřeno 16S rRNA genů obou Bordetella pertussis a Bordetella holmesii, které jsou 99.5% homologní a shodné amplifikovaného regionu (18).

V zájmu speciate Bordetella dýchacích izolovat a ověřit výsledek genotypical analýza, diskriminační test byl vyvinut v které části recA gen (6, 7), který obsahuje unikátní restrikční enzymové stránce, bylo cílené. Amplifikace B. pertussis (ATCC 9340; American Type Culture Collection, Manassas, Va.) a B. holmesii (ATCC 51541) DNA, stejně jako, které z našich pacientova sputa Gram barvení bylo provedeno, jak je popsáno výše, kromě toho, že 3 mM MgCl2 a nově navržené specifické primery (forward, 5′-CAATACGCCTCCAAGCTGGG-3′; a naopak, 5′-TGATGTCGAACTCGGCCTGC-3′) byly použity, a PCR kroků (94°C 30 s 59°C po dobu 30 s a 72°C po dobu 60 s) byly opakovány 45 krát následuje závěrečné protažení krok při 72°C. Produkty byly štěpeny s NciI podle doporučení výrobce (New England Biolabs, Inc. Beverly, Mše.). Tyto dva organismy lze snadno rozlišit, protože B. holmesii má dvě místa NciI, zatímco B. pertussis a všechny ostatní Bordetella spp. v amplifikované oblasti mají pouze jedno místo NciI. Izolát sputa byl následně identifikován jako B. pertussis (obr. 2) a byl hlášen jako oportunní plicní patogen u pacientů infikovaných virem lidské imunodeficience (4, 5).

dále jsme zkoumali, zda je genotypová identifikace organismů přímo z klinických gramových barviv s univerzálními primery proveditelnou a reprodukovatelnou metodou. Typ fixace (teplo, 100% methanolu a 100% ethanol) a přítomnost barviva, zbytky po Gram barvení, jak je popsáno výše, není v rozporu s PCR. Detekční limit 1 500 CFU / µl sputa (6 až 30 organismů na pole ponoření oleje) byl nalezen, což je podobné jako u jiných zpráv (14). Pro toto zjištění, tři náhodné klinické vzorky sputa bez bakterií na Gram stain, nebo v kultuře byly sloučeny, špičatý s definovanými množství Escherichia coli (ATCC 25922), pevné a Gram obarví, a oškrábat snímek, jak je popsáno výše. Bylo testováno několik náhodně vybraných klinických vzorků, a když byl na mikroskopii viditelný převládající organismus, jeho identifikace odpovídala kultivovanému patogenu (Tabulka 1).

naše metoda má oproti dříve popsaným testům několik výhod. Na rozdíl od předchozích zprávách, ve kterém DNA je nejprve extrahován z hlenu a druhově specifickými primery jsou použity (2, 11, 14, 19, 20), náš test používá DNA získané přímo z Gram-barevné sklíčka bez extrakčních kroků a využívá univerzální primery, což umožňuje identifikaci širokého spektra bakterií s jednoduchým protokolem. Jak je ukázáno, toho lze dosáhnout i za přítomnosti normální flóry rezidentní na pozadí, protože počet cyklů PCR je omezen, což umožňuje konkurenční amplifikaci bakteriální DNA. Vzhledem k tomu, že kvalita předloženého vzorku a relativní podíly morfologicky odlišných mikrobů lze snadno určit na gramových skvrnách, lze před amplifikací DNA zvolit vhodné nátěry. Kromě toho vzhled gramových skvrn převládajícího organismu slouží jako vnitřní kontrola kvality po genotypové identifikaci. Jako s phenotypical identifikaci, výsledky našeho testu musí být v korelaci s klinickým obrazem před léčbou rozhodnutí jsou vyrobeny, protože ani metoda dokáže spolehlivě rozlišovat mezi kolonizace a infekce.

Mezi několik zpráv v anglickém jazyce, literatura popisující oživení nukleové kyseliny z klinických vzorků na sklíčka (3, 8), zatím nikdo popsáno DNA amplifikace po obnovení bakterie Gram-barevné sklíčka. Naše metoda je rychlá a spolehlivá a může být použita jako nástroj v případech, kdy organismy jsou vidět ve velkém množství na klinické Gram-barevné diapozitivy, ale nemohou být získány zpět, v kultuře. Tato technika může být zvláště užitečná, pokud je diagnóza hledána retrospektivně nebo po vyřazení původních vzorků.

tabulka 1.

Analýza klinických sputa a hojení exempláře,

• Copyright © 2004 americká společnost pro mikrobiologii