Vysoce účinná kapalinová chromatografie hmotnostní spektrometrie je extemely univerzální instrumentální techniky, jejichž kořeny spočívají v použití více tradiční kapalinová chromatografie na teorie a instrumentace, které byly původně vyvinuty pro plynovou chromatografii (GC). Jak název napovídá, přístrojové vybavení zahrnuje vysoce výkonný kapalinový chromatograf (HPLC) připojený přes vhodné rozhraní k hmotnostnímu spektrometru (MS). Hlavní výhodou HPLC / MS oproti GC / MS je, že je schopen analyzovat mnohem širší škálu komponent. Sloučeniny, které jsou tepelně labilní, vykazují vysokou polaritu nebo mají vysokou molekulovou hmotnost, mohou být analyzovány pomocí HPLC/MS, dokonce i proteiny mohou být rutinně analyzovány. Řešení odvozené ze vzorků zájmu jsou injekčně do HPLC kolony, která se skládá z úzké trubice z nerezové oceli (obvykle 150 mm délky a 2 mm vnitřní průměr, nebo menší) plný jemné, chemicky modifikované částice oxidu křemičitého. Sloučeniny jsou odděleny na základě jejich relativní interakce s chemickou úpravu povrchu těchto částic (stacionární fáze) a eluční rozpouštědlo througn kolonou (mobilní fáze). Komponenty eluující z chromatografické kolony jsou poté zavedeny do hmotnostního spektrometru prostřednictvím specializovaného rozhraní. Dvě nejběžnější rozhraní používaná pro HPLC / MS jsou elektrosprejová ionizace a rozhraní pro chemickou ionizaci atmosférického tlaku.
Elektrosprejem ionizace
V elektrosprejem ionizace analytu je představen na zdroj v tok sazby typicky pořadí 1µl min-1. Analytu řešení toku prochází elektrosprejem jehlu, která má vysoký potenciál rozdíl (s ohledem na pult elektroda) aplikován na to (obvykle v rozmezí od 2,5 do 4 kV). To nutí postřik nabitých kapiček z jehly povrchovým nábojem stejné polarity k náboji na jehle. Kapičky jsou odpuzovány od jehly směrem ke zdrojovému vzorkovacímu kuželu na protielektrodě (znázorněno modře). Jak kapičky procházejí prostorem mezi špičkou jehly a kuželem, dochází k odpařování rozpouštědla. To je zakroužkováno na obr.1 a zvětšený na obr.2. Jak dochází k odpařování rozpouštědla, kapička se smršťuje, dokud nedosáhne bodu, kdy povrchové napětí již nemůže udržet náboj (Rayleighova hranice), kdy dojde k „Coulombické explozi“ a kapička se roztrhne. To produkuje menší kapičky, které mohou proces opakovat, stejně jako nahé nabité molekuly analytu. Tyto nabité molekuly analytu (nejsou to striktně ionty) mohou být jednotlivě nebo násobně nabité. Jedná se o velmi měkký způsob ionizace, protože při ionizaci je analytem zadrženo velmi málo zbytkové energie. To je generace násobit nabité molekuly, která umožňuje vysoké molekulární hmotnosti komponent, jako jsou bílkoviny, které mají být analyzovány, protože hmotnostní spektrum hmotnostní spektrometr je značně zvýšil, protože to vlastně měří hmotnost účtovat poměr spíše než mass per se. Hlavní nevýhodou této techniky je, že velmi malé (obvykle ne) fragmentaci se vyrábějí, i když to může být překonána díky použití tandemové hmotnostně spektrometrických technik jako je MS/MS nebo MSn.
Obrázek 1 schéma ESI rozhraní,
Obrázek 2 schéma mechanismu vytváření iontů
Atmosférického tlaku chemická ionizace
Atmosférického tlaku chemická ionizace (APCI) je to analogické ionizační metoda chemická ionizace (CI). Významný rozdíl je, že APCI dochází za atmosférického tlaku a její základní aplikace v oblasti ionizace nízká hmotnost sloučeniny (APCI není vhodný pro analýzu tepelně labilní sloučeniny). Obecné nastavení zdroje (viz obr. 3) sdílí silnou podobnost s ESI. Tam, kde se APCI liší od ESI, je způsob ionizace. V ESI, ionizace se kupuje prostřednictvím potenciálního rozdílu mezi stříkací jehlou a kuželem spolu s rychlou, ale jemnou desolvací. V APCI je roztok analytu zaveden do pneumatického nebulizátoru a desolvován ve vyhřívané křemenné trubici před interakcí s koronovým výbojem vytvářejícím ionty. Corona vypouštění nahradí elektron vlákna v CI – atmosférický tlak by se rychle „vyhořet“ žádné vlákna a vytváří primární N2°+ a N4°+ elektronovou ionizací. Tyto primární ionty srazí se odpařuje rozpouštědlo molekuly tvoří sekundární reaktantu plynu ionty – např. H3O+ a (H2O)nH+ (viz Obr. 4). Tyto reaktantové plynové ionty pak procházejí opakovanými srážkami s analytem, což vede k tvorbě analytových iontů. Vysoká frekvence srážek má za následek vysokou účinnost ionizace a termalizaci analytových iontů. To má za následek spektra převážně molekulárních druhů a aduktových iontů s velmi malou fragmentací. Jakmile jsou ionty vytvořeny, vstupují do čerpací a zaostřovací fáze v podstatě stejné jako ESI.
Obrázek 3 schéma součásti APCI zdroj
Obrázek 4 podrobnější pohled na mechanismus APCI
Schémata a text (částečné) Dr. Paul Brány, School of Chemistry, University of Bristol,