PMC

Během translokace krok prodloužení fáze syntézy bílkovin, mRNA je rozšířené o jeden kodon, vázané na pohyb tRNAs z ribozomální A (aminoacyl) – P (peptidyl) a P k E (exit) stránky, v procesu katalyzované prodloužení faktor EF-G (1). První, tRNAs přesunout na 50S podjednotku do P/E a/P hybridní státy, následuje pohyb tRNA anticodon kmenových smyček (ASLs) od 30S podjednotku a a P místa na P a E stránky, respektive, vázané na pohyb jejich přidružené kodony mRNA (2). První krok je doprovázen rotací intersubjunit (3-7), zatímco druhý krok vyžaduje EF·G * GTP a zahrnuje rotaci domény hlavy podjednotky 30S (8-11). I když moc se nedávno dozvěděl o strukturální základě P-tRNA hnutí na E stránky (9, 10, 12, 13), translokace meziprodukty obsahující-tRNA jsou více obtížné pasti. Tak, hodně z našeho myšlení o strukturální základ-tRNA a mRNA hnutí bylo založeno na krystalové struktury EF-G vázán na volné (14) nebo P-tRNA obsahující ribozomu komplexy uvězněni v klasické (15) nebo hybridní státy (10, 12, 13) a dva kryo-EM struktur 70S ribozomu-EF-G komplexy obsahující dva tRNAs vázán v P/E a/P* hybridní států (16), nebo, v ap/P a pe/E chimerická hybridní států (11).

Tady máme zprávy krystalové struktury z 70. let translokace ribozomu meziprodukt obsahující EF-G, mRNA, a dva tRNAs – deacylated tRNA vázány v pe/E stát, a peptidyl-tRNA v pasti v ap/ap chimerická hybridní státu. Komplex byl tvořen s T. thermophilus 70S ribozomy, 39 nukleotidů mRNA, elongator tRNAMet v P místě a N-acetyl-Val-tRNAVal v místě. K zachycení translokačního meziproduktu jsme přidali neomycin k zablokování dokončení translokace a kyselinu fusidovou k zabránění uvolňování EF-G (doplňkové metody; obr. S1). Struktura byla řešena pomocí difrakčních dat na 3,8 Å získaných z jednoho krystalu (tabulka S1). Příklady elektronové hustoty jsou uvedeny v doplňkových materiálech (obr. S2-S13). Vzhledem k ribozomu klasického stavu (17)prochází hlava 30S podjednotky velkou rotací 21° proti směru hodinových ručiček a těleso 30S rotací 2,7° vzhledem k podjednotce 50S (obr. 1, obr. 2A, B). P-tRNA antikodonová kmenová smyčka (ASL) se pohybuje s hlavou 30S do polohy mezi místem P hlavy 30S a místem E těla 30S (pe chimérický stav; 1D, E), zatímco jeho akceptorový konec se plně pohybuje do místa 50S E (obr. 1C) a vytváří chimérický hybridní stav pe/E (9-11). ASL A-tRNA se pohybuje do ~4Å od prvků P-místa těla 30S (obr. 1D); jeho loket se otáčí směrem ke klasické 50S P stránky, ale jeho akceptor konci je vázán mezi 50S podjednotku a a P místa (Obr. 1C), tvořící ap / ap chimérický hybridní stav. Velká rotace 30s hlavy závislá na EF-G v naší struktuře repozice šroubovice H38 23S rRNA, umožňující loket A-tRNA dosáhnout polohy lokte p-site tRNA (obr. S14). Domény IV EF-G je zaklíněný v místě konvergence Na místě mRNA, kodon, anticodon smyčky ap/ap tRNA, a 16S a 23S rRNAs na intersubunit most B2a, současně kontaktovat všechny čtyři RNAs (Obr. S15).

ačkoli rotace hlavy 30S jasně usnadňuje translokaci ASL v místě P (9-11), ASL v místě A je translokována jiným mechanismem. ASL místa P se pohybuje přesně s rotací hlavy 30S do stavu pe / E, zatímco ASL místa A se posunula dále než rotační pohyb hlavy do stavu ap na podjednotce 30S (obr. 1E). Pohyb-site n. m. právě s otáčení hlavy by mohlo způsobit vážné střet s domény IV EF-G, jak je umístěn v našem areálu, který, spolu s kontaktní tvoří mezi špičkou domény IV. kodon-anticodon helix ap/ap tRNA (Obr S16), naznačuje, že pohyb mRNA n. m. a jsou spolu do které domény IV. Dodatečné posunutí ap/ap ASL přináší to v blízkosti pe/E n. m. (Obr. 2C, D) (11). Poloha hlavy může být stabilizována interakcí mezi fosfátem 1210 16S rRNA s doménou IV EF-G v Gly531.

Nejvíce zarážející je uspořádání 16S rRNA 966 smyčky v 30. letech hlavu, která vytrhne z P stránky dostat k webu, kde je iniciuje kontakt s částečně přemístěný ap/ap-n. m. (Obr. 2E, F). Toto uspořádání zahrnuje narušení balení m22G966 proti ribóza 34 P-site n. m. (18, 19), a vytvoření povrch-montáž kapsy kolem ap/ap-ASL o nukleotidy A965, m22G966 a C1400. V krystalové struktuře odpovídajícího komplexu s jednou trnou (10) (obr. S6), pe/E tRNA n. m. bylo zjištěno, že udržet všechny kanonické P-stránky kontakty s 30S hlavy, včetně 966 smyčky, jak se otáčí směrem k E stránky. Nicméně, v dvou-tRNA komplex zde uvedena, pouze dílčí sadu na P-místě 30S hlavu interakce s pe/E n. m. jsou udržovány, zahrnující G1338, A1339, A1340, a C-koncové ocas bílkovin uS9. Vznik post-translokace interakce současně s narušením pre-translokace interakce, navrhuje mechanismus, jak ASLs jsou předávány mezi a a P místa. To může také představovat počáteční posun v kontakty, které musí být přerušeno, aby se uvolnil pe/E tRNA n. m. před back-rotace 30 hlava v závěrečné fázi translokace (20, 21).

síť interakcí tvoří mezi konzervovanou smyčkou 1 (zbytky 499-504) v doméně IV EF-G, ap/ap n. m. a jeho mRNA kodonu (Obr. S15) (11) jsou podobné těm, které byly pozorovány ve stavu po translokaci (15), což naznačuje, že jsou udržovány po celou dobu translokačního cyklu. Jejich podobnost s minor-groove interakce vyrobené pomocí A1492 a A1493 s kodon-anticodon helix v dekódování stránky (22) naznačuje, že mohou pomoci udržet správnou kodon-anticodon párování při pohybu mezi a a P místa (15), a jsou v souladu s návrhem, že EF-G usnadňuje translokaci do destabilizující interakce v 30. letech dekódování stránkách (23).

Interakce mezi mRNA a prvky z 30 hlava v následní mRNA vstupu tunelu byly navrženy nést mRNA vpřed s tRNA při otáčení hlavy (17). Není však jasné, že čistý pohyb mRNA by mohl být tímto způsobem udržován, protože tyto interakce jsou narušeny během rotace hlavy. Zjistili jsme, že rozšířený ocas mRNA, jak to vyplývá z navazujícího tunelu, křivky směrem nahoru se váže na povrch proteinů uS3 v hlavě podjednotky (Obr. 3, S17). Otáčení hlavy dopředu by tedy aktivně pohybovalo mRNA ve směru translokace. Srovnání polohy referenčního nukleotidů na mRNA ve otáčet a non-otáčet státy dále ukazuje, že dopředu otáčení hlavy by předem mRNA o jeden kodon (Obr. 3D), podporující možnost, že mRNA je během translokace aktivně pohybována ribozomem. Vzhledem k tomu, rozměry navazujícím tunelu vyloučit vstup RNA šroubovice, narušení mRNA sekundární struktura ribozomální helicase (24), musí dojít v nebo poblíž vstupu do tunelu, tím, že interakce s ribozomu mimo tunel. Vazba ocasu mRNA bezprostředně lemující vstup do tunelu výhradně k hlavě 30. let poskytuje takovou interakci. Síly vytvořené rotací hlavy by tak mohly destabilizovat párování bází ve spirálovitých prvcích mRNA při vstupu do následného tunelu.

V klasické státní, C74 a C75 v CCA ocas P-stránky tRNA tvoří základní dvojici s G2252 a G2251, respektive v P smyčce, (H80) 23S rRNA, zatímco C75-stránky tRNA dvojici s G2553 ve smyčce (H92) (18, 25, 26). Tyto interakce pozici peptidyl a aminoacyl skupiny pro peptidyl transferázy reakce (27), který zanechává deacylated tRNA v P místě, a v centru peptidyl-tRNA v A místě. Kritickým krokem v translokaci je proto následný pohyb konce peptidyl-CCA ze smyčky a do smyčky P. Struktura translokačního meziproduktu odhaluje chimérický stav, odlišný od dříve popsaných (obr. S18), ve kterém akceptorový konec peptidyl-tRNA interaguje současně s a i p smyčkou (obr. 4). V tomto stavu, základní párování C75 s G2553 ze smyčky je zachována, zatímco pohyb jeho akceptor dříku do polohy, blízkosti, že z klasické P-stránky tRNA umožňuje G2252 a G2253 v přeskupeny P smyčky kontaktovat tRNA páteř v místech, 72 a 70 (Obr. 4B). Tak, konec akceptor kmenových ap/ap-tRNA je zakotvena v P smyčce, usnadnit přenos jeho přilehlé C74 a C75 zbytky ze smyčky do smyčky P. A76 ap/ap tRNA je orientována podobně, které jsou pozorovány pro tRNA vázány v P/P klasickou státní (17), s N-acetyl-valin peptidyl skupinu umístěn u vchodu do peptidu výstupním tunelu, vzhledem k tomu, C74 a C75 udržovat jejich interakce s smyčky 23S rRNA (Obr. 4, S19).

akceptor konci ap/ap tRNA současně kontakty a a P smyčky 23S rRNA

Během translokace, 3′ akceptor konce peptidyl-tRNA se přesune z (A) klasický A/A stát (B) střední ap/ap státu (C) klasické P/P státům, usnadnil tím, že konformační změny v a a P smyček.

ap/ap-tRNA může odpovídat přechodné stavy, které byly charakterizovány kineticky. Fluorescenční zhášení kinetické studie identifikovány EF-G-dependent intermediate (INT), ve které je peptidyl-tRNA loket se pohybuje z místa na P stránky, ale zůstává pouze částečně reaktivní s aminoacyl-tRNA napodobují puromycinu, což naznačuje, že jeho CCA konec není plně ubytováni do P místa (28). Kinetické studie, ve které sonda byla připojena přímo k peptidyl-tRNA CCA konce, označené EF-G-dependentní translokace meziprodukty, v nichž akceptor konce peptidyl-tRNA se přesune na P stránky, ale zůstává puromycinu-nereaktivní (29). Vlastnosti těchto meziproduktů jsou slučitelné se zachyceným stavem ap/ap pozorovaným zde. Struktura této pasti translokace intermediate začne popisovat, jak tRNA se pohybuje mezi ribozomální a a P místa. TRNA vazebných míst jsou samy o sobě dynamické, které tvoří současné kontakty mezi A-tRNA a prvky z obou a a P místa, připomínající předávání štafetu v štafetový závod (30). To je vidět jak 30S a 50S podjednotky. V podjednotce 30S, přeskupení smyčky 966 16S rRNA uvolňuje G966 z ASL P-site, aby kontaktoval ASL a-site, když se pohybuje do místa 30S P (obr. 2E, F). V 50S podjednotku, a a P smyčky 23S rRNA uspořádání, aby obě smyčky se obrátit na 3′-dodavatel end-stránky tRNA, jak to začíná svůj přechod do 50. let P stránky (Obr. 4). Tato zjištění ukazují, že strukturální dynamika ribozomální RNA hraje aktivní roli v mechanismu translokace.