Tam je často hodně zmatek ohledně významu enzymu jednotky‘, ‚enzymové aktivity a specifické enzymové aktivity‘. Tato příručka vysvětluje tyto klíčové pojmy jednoduše a pojednává o návrhu enzymových testů a důležitosti provozu v „lineárním rozsahu“. Zvažujeme také standardní křivky a to, zda byste měli vykreslit koncentraci nebo absolutní množství produktu na ose x. Jsou diskutovány některé tipy pro nastavení kontrol testů a odečítání polotovarů. Nakonec vysvětlíme, jak se vypočítávají hodnoty enzymové aktivity, a poskytneme jednoduchý přehled kinetických rovnic.
definice enzymových jednotek
enzymologie by byla méně komplikovaná, kdyby všichni používali stejnou definici jednotek. Standardní definice jednotky je uveden níže:
1 jednotka (U) je množství enzymu, které katalyzuje reakce 1 umol substrátu za minutu (definice).
Ve většině R&D nastavení 1 umol substrátu je vlastně docela hodně materiálu a ostatních definice může být populární, aby se zabránilo vyjádření množství ve zlomcích jednotek. Běžně se používá následující nestandardní definice:
1 jednotka (U) je množství enzymu, které katalyzuje reakci 1 nmol substrátu za minutu (definice B).
Všimněte si, že změna ve vymezení má zásadní vliv na uvedený počet jednotek 1 jednotka, tj. enzymu, podle definice by se rovnala 1000 jednotek podle definice B!
můžete také vidět jednotek enzymu vyjádřená jako milli-jednotky (nebo mU), což jednoduše znamená tisícinu jednotky, bez ohledu na to, jak jednotka byla definována.
je zřejmé, že skutečné množství enzymu ve zkumavce se nemění jednoduše tím, že mění definice jednotky, ale péče je zapotřebí při porovnání aktivity vzorků od různých dodavatelů. Pokud jsou k dispozici definice jednotek, můžete transformovat uvedený počet jednotek na nmol za minutu, což je jednoznačné a umožňuje provést platná srovnání.
pro přehlednost ve své vlastní práci můžete raději použít „nmol per min“ (nebo „umol per min“), i když je-li vyžadováno neustálé opakování, pak má mnohem kratší termín „jednotka“ své zajímavosti.
co je „enzymová aktivita“
aktivita se udává v jednotkách na ml (U / ml), jinými slovy nmol na min na ml (pokud byla přijata definice jednotky B). Hodnoty aktivity vyjádřené v jednotkách tedy podléhají také iluzornímu 1000násobnému „zvýšení“, pokud se přepne z definice jednotky A na definici jednotky B. Opět nemůže dojít k záměně, pokud je aktivita vyjádřena spíše jako nmol na min na ml než jednotky na ml.
vzhledem k tomu, že aktivita souvisí s koncentrací, vyplývá, že dvě injekční lahvičky enzymu mohou obsahovat stejný počet jednotek (celkem), ale mají různé aktivity (koncentrace).
co je specifická enzymová aktivita?
specifická enzymová aktivita (obvykle uváděná jednoduše jako „specifická aktivita“) je počet enzymových jednotek na ml dělený koncentrací proteinu v mg / ml. Specifické hodnoty aktivity se proto uvádějí jako jednotky / mg nebo nmol / min / mg (pokud se použije definice jednotky B).
specifická aktivita je důležitým měřítkem čistoty enzymu a hodnoty pro různé šarže čistého enzymu by měly být stejné, v rámci normální experimentální chyby.
Sériové ředění roztok enzymu mají různé enzymové aktivity hodnoty, ale stejné konkrétní hodnoty aktivity, protože při výpočtu specifické aktivity čitatel (jednotek/ml) a jmenovatele (mg/ml), jsou ovlivněny stejně ředění vzorku.
i když konkrétní činnost je velmi odlišná od aktivity, výpočet specifické aktivity, nicméně je závislá na aktivitě hodnotu, a proto uvádí konkrétní hodnota aktivity bude také závislá na enzymu jednotka definice. Šarže, které jsou pod očekávanou specifickou hodnotou aktivity, mohou obsahovat nečistoty nebo molekuly enzymů, které se denaturovaly.
faktory ovlivňující enzymatickou aktivitu
v této části diskutujeme, proč může mít jeden enzym různé naměřené hodnoty aktivity v různých laboratořích. Tím máme na mysli skutečné rozdíly v měřené aktivitě, nikoli zjevné rozdíly způsobené použitím různých definic jednotek.
podmínky, za kterých se provádí test, ovlivní vykazované hodnoty aktivity. Například, testy jsou obvykle provádí při teplotě v rozmezí 20-37°C. Obecně platí, že enzym bude více aktivní při 37°C než při 20°C.
definice enzymu jednotka by lépe vyjádřil takto:
1 jednotka (U) je množství enzymu, které katalyzuje reakce 1 nmol substrátu za minutu za standardních podmínek.
termín „standardní podmínky“ je bohužel otevřený interpretaci a mohou existovat různé uživatelské preference, alespoň v prostředích R&D. Deset různých výzkumných laboratoří tedy může (zcela správně) vypočítat různé aktivity pro stejný roztok enzymu. Většina výzkumných laboratoří stanoví své vlastní „standardní podmínky“ a každou novou dávku interně kontroluje. V klinických podmínkách jsou explicitně definovány „standardní podmínky“ a všechny laboratoře jsou povinny provádět stejné testy.
vývoj testů a význam lineárního rozmezí
hodnota aktivity (jednotky/ml) pro váš enzym je nejdůležitějším parametrem při vývoji testu. Počet jednotek), které přidáte, určí množství substrátu, který je převeden na produkt. Nezapomeňte, že 1 jednotka katalyzuje přeměnu 1 nmol substrátu za minutu (definice B).
vykázaných jednotek/ml může dát hrubou představu o tom, kolik enzymu přidat, ale jako činnost, hodnota nemusí být určena v testu identický s tím tvým, to je obvyklé připravte sériové ředění enzymu (např. log ředění zpočátku) a test stanovený objem každého ředění. V závislosti na testu signál (který bude ve vztahu k množství substrátu konvertoval) druhý experiment může být požadováno, aby doma v na vhodném naředění.
Co přesně je „nejlepší“ ředění? Abychom na to odpověděli, musíme přemýšlet o nejdůležitějším aspektu návrhu testu-lineárním rozsahu. Pro kvantitativní práci je důležité pracovat v rozsahu, ve kterém je lineární graf testovacího signálu (často absorbance) versus koncentrace enzymu. Většina testů je lineární, pokud je stupeň konverze substrátu menší než 15%, za předpokladu, že neexistují žádné další omezující faktory. Stanovením doby stanovení (např. 30 min) a teploty (např. 25oC) lze stupeň konverze regulovat jednoduše úpravou jednoho parametru, tj. počtu přidaných enzymových jednotek.
to je graficky znázorněno na obrázku 1 s ředěním vyjádřeným jako vratné hodnoty (tj. ředění 1/10 = 0,1 na ose x). Vlastní děj se může lišit v jeho tvaru a lineární rozsah, ale při velmi vysoké koncentrace enzymu nepochybně test signálu se zvýší v poměru k množství enzymu, dodal.
test na Obrázku 1 je lineární až do optické hustoty (OD) 2.5 a ředicí faktor 0,02 (1/50 ředění enzymu) by bylo ideální pro test práce, protože to dává velký signál (~1.5) a leží ve středu lineární řady. Výpočty na základě výsledků faktorů ředění v rozmezí mezi 0,04 a 0,12 (tj. regionu s omezenou svahu) bude podceňovat skutečné úrovni enzymové aktivity, protože něco, co je jasně omezit rozsah analýzy signálu.
pro omezení lineárního rozsahu může fungovat mnoho faktorů a rozsah se bude lišit od testu k testu. Jeden obyčejný důvod pro non-linearity je nadměrná spotřeba substrátu, což může způsobit, že rychlost reakce klesá, ale omezení optické komponenty desky reader (nebo cokoliv měřicí přístroj je použit) může být také významné. Většina čteček desek například nemůže spolehlivě měřit hodnoty absorbance nad 3 A toto omezení bude platit bez ohledu na procento substrátu, který byl převeden na produkt.
obr 1. Absorbance Oproti Množství Enzymu,
i když to není jinak uvedeno v této příručce, jeden by měl také být vědomi toho, že enzymy mohou denaturovat v průběhu času, zejména pokud jsou velmi zředěné, a produkty některých reakcí může inhibovat enzym. Existují i jiné možné důvody pro nelineární chování, ale obvykle je relativně snadné najít lineární rozsah pokusem a omylem pomocí sériových ředění enzymu, jak je popsáno výše.
čas a teplota testu
tyto parametry mohou také ovlivnit lineární rozsah, protože ovlivňují rychlost konverze substrátu. Například test může být lineární po 15 minutách, ale po 60 minutách mohlo být spotřebováno příliš mnoho substrátu. V této situaci byste museli snížit množství enzymu, abyste mohli provést test po dobu 60 minut. Stejné úvahy platí pro teplotu testu, protože může také ovlivnit rychlost reakce.
většina lidí přijímá čas testu někde mezi 15 min a 60 min. Velmi krátké časy (např. 2 min) je třeba se vyhnout, protože mírné zpoždění v zastavení reakce povede k významné chybě ve výpočtech činnosti. Je důležité zajistit, aby činidla uložená v lednici nebo mrazničce byla před použitím vyrovnána na správnou teplotu, což je zvláště důležité, pokud máte relativně krátkou dobu testu.
objem / citlivost testu
z praktického hlediska je objem testu určen / omezen spotřebním materiálem, který používáte pro své testy(např. kyvety, zkumavky nebo mikrodestičky). Signál pro většinu enzymových testů je úměrný objemu testu a pokusy o miniaturizaci testu (např. pro zachování činidel) obvykle vedou k nižším signálům. Absorpční testy jsou však často výjimkou a přechod z 3ml kyvety na 1ml mikro-kyvety například nezmění odečet absorbance, pokud je šířka (délka dráhy) kyvety stále 1 cm (tj. světlo stále prochází stejnou „délkou“ kapaliny). Je to proto, že absorbance je úměrná délce dráhy, nikoli objemu vzorku.
V mikrotitrační destičce absorbance testy, délka cesty je rovna hloubce kapaliny, a je možné miniaturise bez ztráty signálu tím, že sníží průměr studny a udržování konstantní hloubce kapaliny. Například, 96 dobře desky lze snadno přizpůsobit 200 ul vzorku, ale s 50ul testu hlasitosti by bylo lepší použít 384-well plate pro zvýšení délky dráhy přes to vidět s 50ul vzorku v 96jamkové destičce.
Průběžné Testy (Měření Vzhled Výrobku v průběhu Času)
Většina testů se provádí na pevně stanovenou dobu (end point testy) a reakce je zastavena přidáním stop činidla (např. kyseliny). V kontinuálních testech se však průběžně zaznamenává vzhled produktu (méně často spotřeba substrátu) (např. pomocí zapisovače grafů). Platí stejná základní pravidla; graf signálu versus čas pro pevné množství enzymu by měl být lineární a rychlost by se měla zdvojnásobit, pokud se množství enzymu zdvojnásobí. Dokud je test provozován v lineárním rozsahu, může být aktivita vhodně zředěných „neznámých“ přesně určena z počátečních rychlostí reakce měřených pomocí souboru norem.
jakou koncentraci substrátu mám použít?
koncentrace substrátu ovlivní rychlost reakce, ale při výběru „správné“ koncentrace je třeba zvážit několik faktorů. Z praktického hlediska je jedním z klíčových hledisek množství produktu, které musí být vygenerováno, aby bylo možné poskytnout měřitelný testovací signál. Protože rychlost enzym, reakce, je pravděpodobné, že na podzim, kdy více než o 15% substrát hydrolyzovaný, počáteční koncentrace substrátu by obecně měla být alespoň 10x koncentrace produktu, který je známo, že dát přijatelný test signálu.
Další úvahou je Km pro substrát. Zatímco přidání více substrátu obecně znamená, že uvidíte vyšší hodnoty aktivity, vztah není lineární a může být nutné zvážit náklady na substrát. V tomto bodě je pravděpodobně užitečné představit klasickou Michaelis-Mentenovu rovnici:
v = (Vmax S)/(Km + S) ……………. Eqn. (1)
kde v je rychlost, Vmax je maximální rychlost, S je koncentrace substrátu a Km je rovna koncentraci substrátu, který dává polovinu maximální aktivitu. Odvození této rovnice a její základní předpoklady lze nalézt v jakékoli textové knize o kinetice enzymů. I když je normální měřit spíše než vypočítat rychlost enzymových reakcí, je užitečné pochopit základní principy pro účely návrhu testu.
Michaelisova-Mentenova rovnice je užitečná v tom, že vám pomůže vybrat vhodnou koncentraci substrátu, pokud je Km známa.
Když S=Km, v = (Vmax S) / 2S, tj. v / Vmax = S / 2S = ½.
jinými slovy enzym bude pracovat při 50% maximální možné rychlosti, když S=Km.
Tím, že dosazením do rovnice 1 hodnot pro S = 10 a Km = 1, uvidíte, že zvýšením koncentrace substrátu 10-krát enzymu nyní pracuje na ~90% maximální možné rychlosti, místo 50%. Je zřejmé, že je to vyšší, ale ne 10krát vyšší.
při velmi vysokých koncentracích substrátu se Km v rovnici 1 číselně stává nevýznamným a naměřená rychlost se pak rovná Vmax.
mnoho testů se provádí s koncentrací substrátu na hodnotě Km nebo kolem ní, ale pokud je Km velmi vysoká, nemusí být možné použít tak vysokou koncentraci substrátu (např. z důvodů nákladů nebo omezené rozpustnosti).
v některých situacích může být dokonce vhodné použít relativně nízkou koncentraci substrátu. Například při objevu farmaceutických léčiv by použití velmi vysokých koncentrací substrátu ztížilo identifikaci kompetitivních inhibitorů enzymů(kompetitivní inhibitory se váží na stejné místo jako substrát).
rovnováhy různých faktorů, musí být udeřen tak, že test má měřitelný signál, může být provozován v lineární škále a může splnit jiné stanovení cílů (např. náklady, čas a tak dále).
standardní křivky
Pokud chcete vypočítat aktivitu enzymu, je vždy vyžadována standardní křivka. Není nezbytné, pokud Vás zajímají pouze relativní hodnoty aktivity.
standardní křivka je konstruována měřením testovacího signálu se standardními roztoky reakčního produktu ve vhodném rozsahu koncentrací. V ideálním případě byste měli spustit standardní křivku pro každý experiment, ale pokud je standardní křivka vysoce reprodukovatelná, může být přijatelné ji pravidelně spouštět.
typická standardní křivka je znázorněna na obrázku 2 níže. Toto je standardní křivka pro atpázový test, ve kterém je ATP hydrolyzován na ADP a Pi (anorganický fosfát).
obr 2. Standardní křivka pro Pi
fosfát se detekuje pomocí činidla vázajícího barvivo, které mění barvu v přítomnosti fosfátu. Nicméně, specifika tohoto testu nejsou důležité; bez ohledu na povahu výrobku nebo metody detekce, které se používá, standardní křivka zobrazující závislost signálu na množství produktu v testu musí být postavena. „Křivka“ (ideálně přímka) se používá ke stanovení množství produktu generovaného ve vzorcích s neznámou aktivitou, tj. z hodnoty absorbance, odečtením průsečíku na ose x. (Většina grafických softwarových balíčků automaticky vypočítá hodnoty x z naměřených hodnot y). Množství aktivity pak lze vypočítat (viz dále).
Zakreslím koncentraci nebo absolutní hodnotu na osu X?
zde neexistuje jediná správná odpověď a možnost použití obou přístupů může často způsobit zmatek při výpočtu hodnot aktivity. Například vykreslení nmol produktu na osu x je velmi výhodné, pokud potřebujete vypočítat hodnoty aktivity (pamatujte, aktivita = nmol za min na ml). Laboratorní činidla se však obvykle připravují ve známých koncentracích a často je snazší vykreslit tyto hodnoty na ose x. Nicméně, při výpočtu aktivity (či konkrétní aktivity) enzymu musíte si uvědomit, pro převod koncentrace na ose x do počtu nmoles produktu vytvořena, což znamená, že musíte vzít v úvahu stanovení objemu. Důvod je snadno pochopitelný: 50ul a 100ul objemy standardního roztoku bude ve stejné koncentraci, ale větší objem bude obsahovat dvojnásobné množství produktu. Obecně, to je nejlepší vybrat jeden přístup (tj. buď spiknutí, absolutní množství produktu nebo koncentrace) tak, aby stejné metody výpočtu aktivity je vždy použita.
kontroly a odečítání „prázdných“ dat
správné kontroly jsou životně důležité pro kvantitativní práci, stejně jako správné použití kontrolních dat ve výpočtech.
ovládací prvky vám (nepřímo) řeknou, kolik testovacího signálu je způsobeno působením enzymu a kolik vzniká z jiných důvodů. Častým zdrojem „falešného“ signálu je substrát(který může být často kontaminován produktem). Jiné komponenty testu mohou také vést k malému signálu v závislosti na povaze komponent a typu testu. Účelem kontrol je umožnit odstranění (odečtením) všech prvků celkového signálu, které nesouvisejí s působením enzymu. Pokud je test dobře navržen a testovací činidla jsou kvalitní, zpracování kontrol je obvykle poměrně jednoduché.
Některé obecné pokyny jsou uvedeny níže:
Pokud se vrátíme k kolorimetrický test pro detekci anorganických fosfátů můžeme poukázat na některé možné problémy, které jsou snadno detekovány s řádné kontroly.
činidlo pro detekci fosfátů poskytuje nízkou hodnotu asi 0,08 v destičce s 96 jamkami při vlnové délce použité pro měření (kolem 650nm).
Jsme mohli nastavit následující testy/ovládací prvky (hodnoty v závorce v hypotetické assay situace):
- Všechny zkoušky komponent mínus enzymu (0.5)
- Enzym na to vlastní (0.1)
- Enzym plus všechny ostatní komponenty (1.8)
Jasně testu signál 1,8 není způsoben pouze působením enzymu na substrát.
pro jakýkoli test enzymu je klíčovou kontrolou (a) vynechání enzymu (a jeho nahrazení pufrem). Tím získáte signál pozadí pro všechny ostatní komponenty testu jako skupinu, včetně substrátu, který může obsahovat malé množství produktu. Tato kontrola vám neřekne signál pozadí enzymu, ale zjevně nemůžete přidat enzym do substrátu jako kontrolu! Ve většině testů enzym nedává žádný signál, protože je před použitím v testu významně zředěn. To lze snadno zkontrolovat, jako v B výše.
údaje pro vzorek a (výše) naznačují, že směs je kontaminována anorganickým fosfátem. Jednotlivé komponenty pak mohou být zkontrolovány, aby se identifikoval zdroj problému. Tato situace je docela běžné, že testy ATPases a další fosfát – generujících enzymů, jako substráty jsou často nestabilní a jsou částečně hydrolyzované dát nějaké anorganického fosfátu.
může být nepříjemné opravit nezpracovaná data, pokud několik komponent dává falešné signály; odstranění problému u zdroje je obecně mnohem lepší než jakékoli matematické zacházení. ‚Opraveno‘ hodnota pro vzorek C výše se může zdát být 1,2 (tj. 1.8 – 0.5 – 0.1), ale přísně vzato to je špatně. Vzpomeňte si na test desky plus detekční činidla dát na pozadí, signál kolem 0.08, takže zdrojem signálu pro ovládání je plastové desky a/nebo detekčního činidla. Stejný malý signál musí být také skrytý v hodnotě pro kontrolu enzymu. Ve výše uvedené korekci jsme tedy tento skrytý blank odečetli dvakrát.
vždy budete muset odečíst kontroly z dat testu a je vhodnější kombinovat všechny látky (kromě enzymu) a odečíst jednu hodnotu. Pokud tento přístup je přijato, standardní křivka je zacházeno stejným způsobem a kontrolovat hodnoty se odečte (tj. hodnoty získané v nepřítomnosti výrobku, tj. analogická deska/reagenční blank je popsáno výše). Tedy ani odečíst assay data, ani odečteny standardní křivka obsahuje potenciálně zavádějící pozadí signálu způsobené deska/assay reagent.
konečně, jak jsme viděli, falešné signály jsou snadno detekovány pomocí správných ovládacích prvků, ale nejlepší strategií pro získání kvalitních dat je použití činidel s nízkým pozadím, takže hodnoty kontrol jsou nízké. Je také užitečné generovat testový signál (kvůli enzymu), který je mnohem vyšší než jakýkoli signál na pozadí. V ideálním případě by poměr signálu k pozadí měl být alespoň 5 a nejlépe 10 nebo více pro přesnou kvantitativní práci.
výpočet hodnot aktivity
to je poměrně snadné pochopit, pokud zpětně vypočítáme ze surových dat testu krok za krokem. Například, řekněme, že jsme vygenerovali 10nmol produktu v naší enzymové reakci (tj. stanoveno ze standardní křivky signálu versus absolutní množství produktu). Protože aktivita je vyjádřena jako nmol / min / ml, musíme zvážit, čas a objem, a možná méně, je zřejmé, že množství a ředění enzymu, aby bylo možné vypočítat aktivitu.
Pokud je test dlouhý 10 minut, je počet nmol za min ve výše uvedeném příkladu 1. (Krok 1)
Pokud je objem testu 200ul, musíme vynásobit 5 (tj. (Krok 2)
tato hodnota se týká aktivity enzymu v testu, nikoli ve vzorku enzymu použitého k nastavení testu. K určení aktivity enzymu v původním vzorku enzymu jsou zapotřebí některé další korekční faktory.
enzym mohl být před použitím naředěn a musí být dále naředěn dalšími složkami přítomnými v testu. Pokud test (200 ul celkem) zahrnuje 20ul enzymu a enzym je pre-zředěný 1/100 před 20ul vzorku je přidán, můžete pravděpodobně vidět, že bychom měli násobit nejprve 10 (krok 3) a pak 100 (krok 4), aby se aktivita enzymu v původním roztoku enzymu.
zatím je to relativně jednoduché. Dříve jsme však zmínili, že koncentrace je často vynesena na ose x standardní křivky. Hodnoty tedy mohou být vyjádřeny v mm (nikoli mmol) a počet mmol nelze určit jednoduše kontrolou standardní křivky.
vzhledem k tomu, že mM znamená mmoles na litr, máme rozpor mezi implikovaným objemem 1L a skutečným objemem testu. Pokud tedy máme produkt 10mM a objem testu je 200ul, musíme vydělit 5000, abychom získali počet mmolů produktu.
zde si můžete všimnout, že dělení 5000 zde kompenzuje některé operace násobení, které byly vyžadovány výše. Ve skutečnosti je zcela normální, že se korekční faktory zruší. Například, v 10 minutový test pomocí 1/10 zředěného enzymu, vás bude dělit 10, abych dostal nmol / min a vynásobit 10 později na správnou pro ředicí faktor.
z toho vyplývá, že pokud vždy používáte standardní zkušební podmínky (tj. vaše standardní), budete moci násobit “ x “ hodnotu ze standardní křivky o jeden globální korekční součinitel, který zahrnuje všechny ostatní jednotlivé korekční faktory pro výpočet hodnoty aktivity. Pouze při první příležitosti musíte identifikovat jednotlivé korekční faktory.
inhibice enzymů / Screening léčiv
Jedná se o oblast enzymologie, kde zůstává potřeba pracovat v lineárním rozmezí, ale kde výpočty hodnot aktivity obvykle nejsou relevantní; spíše relativní rychlost reakce (nebo relativní množství produktu tvořen) v přítomnosti a nepřítomnosti testované látky je klíč, který vyžaduje trochu víc než jednoduché výpočty pomocí prázdné – odečte assay data. Po odečtení polotovarů se množství vytvořeného produktu vyjádří jako procento z množství získaného v nepřítomnosti zkoušené látky (tj. Tyto testy mohou být někdy prováděny s poměrně nízkým poměrem signálu k pozadí, protože je položena otázka – inhibuje zkoušená látka reakci?
– vyžaduje pouze odpověď ano / ne.
Shrnutí
doufejme, že Tento průvodce poskytuje jasné vysvětlení ‚enzymu jednotky‘, ‚enzymové aktivity a specifické enzymové aktivity, a jednotka definice a význam ‚lineární rozsah. Specifika toho, co vykreslit na ose x standardních křivek, je věcí preferencí uživatele, ale při výpočtu činností je nutná určitá péče. Kontroly testu jsou důležité, ale použití vysoce kvalitních činidel je lepší než odstranění pozadí pomocí matematických přístupů. Pro kvantitativní práci je žádoucí vysoký poměr signálu k pozadí a pro zvýšení testovacího signálu lze měnit řadu parametrů; není vždy nutné jednoduše přidat další enzym. Hodnoty aktivity enzymu lze snadno vypočítat, pokud se k identifikaci klíčových proměnných testu použije postupný přístup.
Zobrazit více protokolů a návodů