Vliv cholesterolu na strukturu fosfolipidové dvojvrstvy

klíčová slova:

• biomembrán
• molekulární simulace
• fáze chování
• dimyristoylphosphatidylcholine
• mesoskopických model

V tomto článku se budeme zabývat zdánlivě jednoduché termodynamické otázka: jak se plocha na molekuly fosfolipidů membrány změnit, pokud přidáme cholesterol? Tato otázka byla poprvé položena Leathes (1) v roce 1925 a je stále diskutována dnes. Význam této otázky se přímo týká významu cholesterolu pro fungování membrán vyšších eukaryot. Například cholesterol reguluje tekutost membrány a moduluje funkci membránových proteinů (2). Pochopení těchto mechanismů motivovalo mnoho vědců k podrobnému zkoumání interakcí lipid-cholesterol. Protože membrána může být viděn jako 2D kapalina, první odhad toho, jak je plocha na molekulu změní po přidání cholesterolu by se předpokládat, ideální míchání, kde je plocha na molekulu je jednoduše vážený průměr pure-součásti oblastí. V roce 1925 Leathes ukázal, že místo ideálního míchání pozorujeme nápadné neideální chování (1). Toto neideální chování se nazývá kondenzační efekt (3), protože plocha na molekulu je mnohem nižší ve srovnání s ideálním mícháním. Protože se membrána chová jako nestlačitelná tekutina, bude mít snížení plochy na molekulu za následek odpovídající významné zvýšení celkové tloušťky dvojvrstvy. Takové zvýšení tloušťky signalizuje reorganizaci struktury membrány. Protože změny ve struktuře membrány mohou mít významné důsledky pro fungování proteinů (2), je důležité, aby měli lepší porozumění molekulárním cholesterolu navozené změny.

byly navrženy různé koncepční modely pro vysvětlení neideálních interakcí cholesterolu a lipidů. Příklady zahrnují model kondenzovaných komplexů (4, 5), model superlattice (6) a model deštníku (7). Model kondenzovaných komplexů vysvětluje kondenzační účinek tím, že předpokládá, že cholesterol indukuje reverzibilní tvorbu stechiometrického komplexu cholesterol-lipid. V takovém komplexu je membrána kondenzována, protože lipidové acylové řetězce jsou více uspořádány. Při dané koncentraci cholesterolu existuje rovnovážné složení mezi těmito kondenzovanými komplexy cholesterolu a lipidů a běžnými lipidy. Model superlattice předpokládá, že v kritických koncentracích vykazují molekuly cholesterolu specifický řád s dlouhým dosahem. Zastřešující model zastává názor, že hydrofilní část cholesterolu je příliš malá, a proto lipidy musí přispívat k screeningu molekul cholesterolu z hydrofobních interakcí s vodou. Fosfolipidy mohou vytvořit tento deštník, pouze pokud se tyto molekuly narovnají, aby vytvořily prostor pro cholesterol. V těchto modelech jsou základní mechanismy vedoucí ke kondenzaci velmi odlišné. Zajímavé je, že nedávné experimentální studie dospěla k závěru, že jejich údaje podporované kondenzované komplexy model (8), vzhledem k tomu, že další sada experimentů nenašel žádné označení kondenzované komplexy a podporuje deštník model (9). Tyto rozdíly v poznatcích nás motivovaly k vývoji mezoskopického modelu systému lipid-cholesterol-voda. Použili jsme molekulární simulace, abychom osvětlili laterální organizaci cholesterolu v lipidových membránách a základní interakce lipid-cholesterol, které indukují kondenzační účinek.

v literatuře bylo popsáno několik molekulárních simulací all-atomových a hrubozrnných modelů cholesterolu v lipidových dvojvrstvách (některé nedávné příklady viz refs. 10-13 a odkazy na ně). V ideálním případě by člověk chtěl použít all-atomové simulace ke studiu kondenzačního účinku ve velkém rozsahu teplot a kompozic. V současné době jsou však tyto simulace příliš časově náročné. Proto používáme hrubozrnný model, ve kterém je účinnost získána integrací některých detailů all-atomového modelu. Náš model je založen na modelu Kranenburg a spolupracovníků (14, 15). Model používá explicitní molekuly vody. Lipidy a cholesterol se skládají z hydrofilních a hydrofobních částic (viz obr. 1). Tento model shlukuje skupiny atomů do jednoho mezoskopického pseudoatomu. Na intramolekulární interakce zahrnují dluhopisů vibrace a dluhopisů ohýbání, jehož parametry byly optimalizovány tak, aby napodobily strukturu jediném all-atom fosfatidylcholin molekuly ve vodě. Hydrofilní a hydrofobní interakce jsou popsány s soft-odpudivé interakce, a parametry jsou tyto interakce týkající se rozpustnosti parametrů pomocí metody popsané Groot a Rabone (16). Myšlenkou tohoto modelu je, že hlavní hnací síly z cholesterolu, fosfolipidů míchání jsou hydrofobní a hydrofilní interakce, což je závěr z mnoha experimentálních studií (7, 9, 17). V našem modelu je jednotka délky přímo spojena s efektivní velikostí pseudoatomu, tj. jeden pseudoatom zabírá objem 90 Å3. Jednotka energie vyplývá z přizpůsobení parametrů měkkého odpuzování mezoskopických částic vody stlačitelnosti vody za okolních podmínek. Jednoduchost modelů vyžaduje reparametrizaci těchto měkkých odpuzování, pokud se změní teplota. V této práci však předpokládáme, že parametry jsou nezávislé na teplotě. Teplotní stupnice je nastavena přizpůsobením teplotám přechodu experimentální fáze. Další podrobnosti a aplikace tohoto modelu lze nalézt v ref. 18.

náš model cholesterolu, znázorněný na obr. 1B, je založen na stejných předpokladech o efektivní velikosti a interakcích jako lipidový model. Následující McMullen et al. (19), udělali jsme hydrofobní část modelu cholesterolu o něco delší než hydrofobní část lipidového modelu, jehož cílem je reprezentovat dimyristoylfosfatidylcholin (DMPC). Pro jednoduchost jsme předpokládali, že hydrofobní a hydrofilní interakce molekuly cholesterolu jsou podobné interakcím v lipidu. Získat vhled do molekulárního mechanismu, kondenzační účinek cholesterolu, jsme zavedli tři cholesterolu-jako molekuly, ve které budeme ničit hydrofobní–hydrofilní rovnováhu molekuly: jeden, ve kterém jsme se snížit hydrofobní délka ocasu (viz Obr. 1C), ve kterém přidáme další hydrofobní skupinu (obr. 1D) a ten, ve kterém nahradíme kroužek jednoduchým řetězcem (obr. 1E).

Obr. 2 znázorňuje vypočtený fázový diagram teplotního složení systému voda-fosfolipid-cholesterol. Fáze hranice byly získány z vizuální kontrolu snímků a více kvantitativně, od inflexní body křivky, které dávají prostor za lipidů, průměrná tloušťka hydrofobní membrány, a ocas pořadí a náklonu parametry. Tyto vlastnosti byly vypočteny jako funkce teploty a obsahu cholesterolu.

nejprve se zaměříme na čistě lipidové fáze a účinek cholesterolu bude dále diskutován. Pro dvojvrstvu čistého lipidu byl fázový diagram vypočítán Kranenburgem a Smitem (14) pro systém, který je čtyřikrát menší. Použili jsme stejnou metodiku k nalezení fázových hranic jako Kranenburg a Smit (14). Naše výsledky jsou ve vynikající shodě s touto studií, což naznačuje, že efekty konečné velikosti jsou malé. U čistého fosfolipidu pozorujeme při vysokých teplotách kapalnou fázi (La), ve které jsou ocasy neuspořádané. Při nízkých teplotách jsou ocasy uspořádány a nakloněny, což definuje gelovou fázi (L ‚ C). Tyto dvě fáze jsou odděleny čeřil fáze (P’β), ve kterém pozorujeme microphase oddělení domén, v nichž dvojvrstvy je silná a lipidy jsou objednané a domén, ve kterém dvojvrstvy je tenký a lipidy neuspořádané. Přítomnost těchto tří fází naznačuje, že výsledný fázový diagram je ve velmi dobré shodě s experimentálním schématem čistého lipidu (20). Teplotní stupnice je nastavena odpovídající teploty fázových přechodů z gelové fáze do zvlnění fáze (Tp) a zvlnění fáze do kapalné fáze (Tm) s odpovídající experimentální fáze přechodu teploty z čistého DMPC. Další srovnání s experimentálními daty je provedeno pro průměrnou plochu na molekulu dvojvrstvy (obr. 3A), pro tloušťku dvouvrstvé vrstvy (obr. 4A) a pro pořadí lipidového ocasu (obr. 4B). Pro plochu na lipid získáme 56 Å2 na molekulu ve srovnání s experimentálními (21) 60 Å2 na molekulu. Pro dvouvrstvá tloušťka vypočítáme hodnotu 38.7 Å, což je v porovnání s experimentální hodnotou 36 Å (21), a podobnou dohodu se získává za ocas pořadí (viz Obr. 4B). Pro výpočet plochy na molekulu pro čistý cholesterol jsme simulovali dvojvrstvu čistého cholesterolu. Získali jsme hodnotu 40,3 Å, což se velmi dobře porovná s nejnovější experimentální hodnotou 41 Å (22) pro monovrstvu cholesterolu. Vzhledem k aproximacím provedeným v našem modelu je dohoda mezi experimentálními a simulovanými hodnotami překvapivě dobrá.

podívejme se nyní na vliv cholesterolu na vlastnosti dvojvrstvy. První otázkou, kterou se budeme zabývat, je, zda náš model dokáže reprodukovat kondenzační efekt. Obr. 3A ukazuje účinek cholesterolu na plochu na molekulu jako funkci koncentrace cholesterolu. Srovnání s experimentálními daty opět ukazuje velmi dobrou shodu. Na tomto obrázku také ukazujeme plochu na molekulu za předpokladu ideálního míchání. Toto číslo přesvědčivě ilustruje kondenzační efekt; plocha na molekulu klesá mnohem více, než by se dalo očekávat na základě ideálního míchání. Další experimentální údaje zahrnují účinek cholesterolu na dvojvrstvý otok (obr. 4A) a parametr pořadí ocasu (obr. 4B). Experimentální data i simulace ukazují, že cholesterol zvyšuje tloušťku dvojvrstvy a její pořadí. Také pro tyto dvě vlastnosti jsou naše simulační výsledky ve velmi dobré shodě s experimentálními daty. Simulace a experimentální data (obr. 3A a 4 A A B) ukazují, že přidání cholesterolu silně modifikuje vlastnosti lipidové dvojvrstvy až do ±30 mol% cholesterolu. Poté se dosáhne oblasti, kde další přidání cholesterolu má jen nepatrný účinek. Při 30 mol% cholesterolu mají jak plocha na molekulu, tak parametry lipidového ocasu a náklonu hodnoty, které jsou typické pro gelovou fázi.

barevné kódování na obr. 2 ukazuje rozdíl mezi simulovanou plochou na lipid a hodnotou odhadovanou za předpokladu ideálního míchání. Pozorujeme, že při vysokých a nízkých teplotách je kondenzační účinek relativně malý. Kondenzační efekt je maximální v dobře definované oblasti ve fázovém prostoru, který je umístěn těsně nad přechodem hlavní fáze čistého fosfolipidu. Abychom lépe porozuměli povaze kondenzačního účinku, je důležité pochopit účinek přidávání cholesterolu na fázové chování membrány.

Obr. 2 ukazuje nejdůležitější vlastnosti fázového diagramu. Různé fáze, které jsme pozorovali v našich simulacích, byly také pozorovány experimentálně, i když ne vždy pro specifickou směs DMPC a cholesterolu (20, 23, 24). Různé experimentální studie však ukazují kvalitativně velmi odlišné fázové diagramy, což omezuje naše možnosti provést podrobné srovnání. Snímky různých fází lze nalézt na obr. 5.

při velmi vysokých teplotách má přidání až 50 mol% cholesterolu malý vliv na strukturu membrány a pozorujeme la fázi pro všechny koncentrace (24). Při teplotách pod Tp pozorujeme, že cholesterol mění strukturu gelové fáze inhibicí náklonu lipidových ocasů, což způsobuje tvorbu L ‚ C fáze (20) (porovnejte obr. 5 D S E). Při vyšších koncentracích cholesterolu (>20%) pozorujeme tvorbu malých shluků bohatých na cholesterol. Tuto fázi označujeme LII a tato fáze je znázorněna na obr. 5E. při teplotách mezi Tp a Tm je čistá dvojvrstva ve fázi zvlnění a cholesterol transformuje tuto fázi zvlnění (viz obr. 5C) do kapalinově uspořádané fáze (23) (obr. 5B). Termín fáze objednané kapalinou zavedli Ipsen et al. (25). Tloušťka dvojvrstvy je mezi tloušťkou kapaliny a gelovou fází střední. Lipidů ocasu-aby parametry mají hodnoty, které jsou v blízkosti gel fáze; nicméně, na rozdíl od gelové fáze, lipidy jsou více neuspořádané a nenaklánějte. Cholesterol postupně zvyšuje teplotu, při které dochází k fázovému přechodu La na Lo. Při velmi vysokých koncentracích cholesterolu se fáze uspořádaná v kapalině transformuje na gelovou fázi (LII), když je teplota snížena pod Tm. Tato fáze byla experimentálně pozorována u dipalmitoylfosfatidylcholinu (26), ale za těchto podmínek jsme nenalezli experimentální data pro DMPC. Vraťme se nyní ke kondenzačnímu efektu. Obr. 2 ukazuje, že kondenzační efekt je maximální při teplotě těsně nad hlavní přechodovou Tm. Důvodem je, že v těchto podmínkách čistý dvojvrstvy v kapalině-neuspořádaný stav, vzhledem k tomu, že kromě cholesterolu v dvojvrstvě mění na kapalinu-nařídil fáze, která má rozlohu za lipidů, která je mnohem menší ve srovnání s kapalinou-neuspořádaný stav. Tento velký rozdíl způsobuje velký kondenzační efekt. Při vyšších teplotách zůstává kapalná fáze stabilní pro všechny koncentrace cholesterolu, což dává mnohem menší kondenzační účinek. Na nižší teploty, čisté lipidové dvojvrstvy má rozlohu per lipid, který je mnohem blíže k oblasti, za lipidů kapaliny-nařídil fáze, a jako výsledek kondenzace účinek je daleko menší.

výše uvedené výsledky naznačují, že kondenzační efekt je přímým důsledkem zejména změn v chování fáze, že cholesterol způsobuje. V literatuře existují různé spekulace o těch aspektech struktury cholesterolu, které jsou specificky zodpovědné za jeho kondenzační účinek. Například, deštník model je založen na představě, že ve srovnání s fosfolipidy, hydrofilní část cholesterolu je mnohem menší a potřebuje fosfolipidů, jako deštník, pro další screening z interakce s vodou. To naznačuje, že další hydrofilní skupina by zcela změnila vlastnosti. Dalším důležitým faktorem je objemná prstencová struktura; pokud nahradíme prsten ocasem, získáme molekulu, která se více podobá molekule alkoholu (27). Zkrácení hydrofobního ocasu by však mělo malý účinek. Obr. 1 ukazuje modifikované molekuly cholesterolu, které napodobují tyto změny. Výsledky na obr. 3B ukazují, že zkrácení ocasu cholesterolu vykazuje stejný kondenzační účinek. Nicméně, Obr. 3B ukazuje, že pro obě další modifikace molekuly cholesterolu, přidání další hydrofilní skupiny a nahrazení kruhu lineárním řetězcem, není pozorován žádný kondenzační účinek. Pozorujeme opačný účinek: přidání těchto molekul způsobí, že se dvojvrstva rozšíří ve srovnání s ideálním mícháním. Účinek (menších) alkoholů na plochu na molekulu byl měřen experimentálně a experimentální data také ukazují nárůst (28). Úzce s tím souvisí, Pozorovali jsme, že v obou případech ve fázovém diagramu byla kapalná fáze stabilní v celém rozsahu koncentrací. Ve skutečnosti, můžeme pozorovat, že přidání těchto molekul se snižuje hlavní přechod teploty, a proto není v regionu fázový diagram, kde je velké kondenzační účinek.

simulace s těmito strukturálními variacemi cholesterolu ukazují, jak překvapivě jemný je mechanismus. Hlavní přechod v čisté dvojvrstvě je velmi citlivý na hydrofobní interakce. Hlavové skupiny lipidů stíní hydrofobní ocasy z vody. Při vysokých teplotách je plocha na lipid vysoká a tento screening není zdaleka optimální; ale za těchto podmínek dominuje entropie řetězce. Snížení teploty činí stále důležitější screening hydrofobních interakcí a při hlavním přechodu nakonec vyvolává uspořádání řetězců. Klíčovým aspektem je pochopit, jak cholesterol destabilizuje kapalnou fázi. Cholesterol má menší hydrofilní hlavu, a proto je méně účinný při stínění hydrofobních interakcí. Při vysokých teplotách to může lipidová dvojvrstva pojmout, ale při nižších teplotách mohou lipidy přispívat k screeningu cholesterolu pouze snížením jeho plochy na lipid. To způsobuje pozorované uspořádání a vysvětluje, proč se hlavní přechod zvyšuje. Dvě změny, které jsme zavedli do struktury cholesterolu, ovlivňují jeho hydrofobní screening; v obou variantách zmizí vnitřní podsvětlení cholesterolu. Pokud jsou tyto molekuly přidány do dvojvrstvy, není třeba další screening hydrofobních interakcí a tyto molekuly zabraňují tvorbě uspořádané fáze.

porovnejme naše pozorování s předchozími modely, které byly zavedeny k vysvětlení kondenzačního efektu. Za prvé, náš model neposkytuje žádné náznaky dálkového uspořádání, jak se předpokládá v modelu superlattice. Implicitní v Zastřešujícím modelu I kondenzovaných komplexech je předpoklad nějaké místní organizace. Například, v deštník model předpokládá, že jeden lipidové molekuly mohl obrazovky jednu nebo dvě sousední molekuly cholesterolu (viz např. ref. 2). Naše simulace ukazují mnohem neuspořádanější strukturu, ve které nemůžeme identifikovat tyto uspořádané struktury. Na tomto místě je důležité připomenout, že náš model obsahuje mnoho předpokladů, a to vyvolává otázku, zda závěrů, které jsme z našich simulací jsou relevantní pro experimentální systémy. Byli jsme velmi překvapeni, když jsme viděli, že jsme byli schopni získat takové bohaté fázové chování pomocí hrubozrnného modelu, který používá čistě odpudivé síly. Náš model poskytuje velmi rozumný kvantitativní popis nedávných experimentálních dat o struktuře dvojvrstvy. Dalším zajímavým aspektem je, že naše výpočty předpovídají, že kondenzační efekt je maximální v úzkém teplotním rozmezí nad hlavním přechodem. Mohlo by to být možné ověřit experimentálně. Velmi přísným testem našeho modelu by bylo podrobné srovnání s diagramem experimentální fáze. V této souvislosti je povzbudivé, že fáze, které jsme našli, byly experimentálně pozorovány, i když ne vždy pro přesně simulovaný systém. Pečlivým výběrem těch experimentálních dat, která souhlasí s našimi simulacemi, bychom mohli dokonce požadovat velmi dobrou shodu. Možným důvodem neshody mezi různými experimenty je to, že se používají různé techniky a ne všechny techniky jsou stejně citlivé na rozdíly ve struktuře různých fází. Doufáme, že kombinace fázového diagramu a podrobných informací o struktuře různých fází poskytuje určité pokyny, zda konkrétní experimentální technika může identifikovat konkrétní fázový přechod.