Effekt af kolesterol på strukturen af et phospholipid-dobbeltlag

nøgleord:

• biomembran
• molekylær simulering
• faseadfærd
• dimyristoylphosphatidylcholin
• mesoskopisk model

i denne artikel behandler vi et tilsyneladende simpelt termodynamisk spørgsmål: Hvordan ændres området pr. molekyle af en phospholipidmembran, hvis vi tilføjer kolesterol? Dette spørgsmål blev først stillet af Leathes (1) i 1925 og diskuteres stadig i dag. Betydningen af dette spørgsmål vedrører direkte betydningen af kolesterol for funktionen af membraner af højere eukaryoter. For eksempel regulerer kolesterol membranens fluiditet og modulerer funktionen af membranproteiner (2). Forståelse af disse mekanismer har motiveret mange forskere til at undersøge lipid–kolesterol interaktioner i detaljer. Fordi en membran kan ses som en 2D-væske, ville et første skøn over, hvordan området pr.molekyle ville ændre sig ved tilsætning af kolesterol, være at antage ideel blanding, hvor området pr. I 1925 viste Leathes, at man i stedet for ideel blanding observerer en slående nonideal adfærd (1). Denne nonideal adfærd kaldes kondenserende effekt (3), fordi området pr.molekyle er meget lavere sammenlignet med ideel blanding. Fordi en membran opfører sig som en ukomprimerbar væske, vil et fald i arealet pr. En sådan forøgelse af tykkelsen signalerer en omorganisering af membranets struktur. Da ændringer i membranstrukturen kan have vigtige konsekvenser for proteinernes funktion (2), er det vigtigt at have en bedre molekylær forståelse af de kolesterolinducerede ændringer.

forskellige konceptuelle modeller er blevet foreslået for at forklare de nonideale kolesterol–lipidinteraktioner. Eksempler inkluderer kondenserede komplekser model (4, 5), superlattice model (6) og Paraply model (7). Den kondenserede kompleksmodel forklarer kondensationseffekten ved at antage, at kolesterol inducerer den reversible dannelse af et støkiometrisk kolesterol–lipidkompleks. I et sådant kompleks kondenseres membranen, da lipidacylkæderne er mere ordnede. Ved en given kolesterolkoncentration findes der en ligevægtssammensætning mellem disse kondenserede kolesterol–lipidkomplekser og almindelige lipider. Superlattice-modellen antager, at kolesterolmolekylerne ved kritiske koncentrationer udviser en specifik langvarig rækkefølge. Paraplymodellen er af den opfattelse, at den hydrofile del af kolesterol er for lille, og derfor skal lipiderne bidrage til screeningen af kolesterolmolekylerne fra hydrofobe interaktioner med vand. Fosfolipiderne kan kun skabe denne paraply, hvis disse molekyler retter sig for at give plads til kolesterol. I disse modeller er de underliggende mekanismer, der fører til kondensering, meget forskellige. Interessant nok konkluderede en nylig eksperimentel undersøgelse, at deres data understøttede modellen med kondenserede komplekser (8), mens et andet sæt eksperimenter ikke fandt nogen indikation af de kondenserede komplekser og understøttede paraplymodellen (9). Disse forskelle i Indsigt motiverede os til at udvikle en mesoskopisk model af et lipid–kolesterol–vand-system. Vi brugte molekylære simuleringer til at kaste lys over den laterale organisering af kolesterol i lipidmembraner og de underliggende lipid–cholesterol-interaktioner, der inducerer kondensationseffekten.

flere molekylære simuleringer af All-atom og grovkornede modeller af kolesterol i lipid dobbeltlag er blevet rapporteret i litteraturen (for nogle nylige eksempler, se refs. 10-13 og henvisninger deri). Ideelt set vil man gerne bruge All-atom-simuleringer til at studere kondenseringseffekten over et stort udvalg af temperaturer og sammensætninger. På nuværende tidspunkt er disse simuleringer imidlertid for tidskrævende. Derfor bruger vi en grovkornet model, hvor effektivitet opnås ved at integrere nogle af detaljerne i en all-atom-model. Vores model er baseret på modellen af Kranenburg og kolleger (14, 15). Modellen bruger eksplicitte vandmolekyler. Lipider og kolesterol består af hydrofile og hydrofobe partikler (se Fig. 1). Denne model klumper grupper af atomer i et mesoskopisk pseudoatom. De intramolekylære interaktioner inkluderer bindingsvibrationer og bindingsbøjning, hvoraf parametrene er optimeret til at efterligne strukturen af et enkelt All-atom phosphatidylcholinmolekyle i vand. De hydrofile og hydrofobe interaktioner beskrives med bløde frastødende interaktioner, og parametrene for disse interaktioner er relateret til opløselighedsparametrene ved anvendelse af metoden beskrevet af Groot og Rabone (16). Ideen med denne model er, at de vigtigste drivkræfter ved kolesterol–phospholipidblanding er de hydrofobe og de hydrofile interaktioner, hvilket er konklusionen af mange eksperimentelle undersøgelser (7, 9, 17). I vores model er længdenheden direkte relateret til den effektive størrelse af et pseudoatom, dvs.et pseudoatom indtager et volumen på 90 liter 3. Energienheden følger af matchningen af de mesoskopiske vandpartiklers bløde afstødningsparametre til kompressibiliteten af vand ved omgivende forhold. Modellernes enkelhed kræver en reparameterisering af disse bløde afstødninger, hvis temperaturen ændres. I dette arbejde antager vi imidlertid, at parametrene er uafhængige af temperaturen. Temperaturskalaen indstilles ved at tilpasse sig de eksperimentelle faseovergangstemperaturer. Yderligere detaljer og anvendelser af denne model kan findes i ref. 18.

vores model af kolesterol, vist i Fig. 1B, er baseret på de samme antagelser om den effektive størrelse og interaktioner som lipidmodellen. Efter McMullen et al. (19) gjorde vi den hydrofobe del af kolesterolmodellen lidt længere end den hydrofobe del af lipidmodellen, der sigter mod at repræsentere dimyristoylphosphatidylcholin (dmpc). For enkelhed har vi antaget, at de hydrofobe og hydrofile interaktioner af et kolesterolmolekyle ligner dem i et lipid. For at få indsigt i den molekylære mekanisme for den kondenserende virkning af kolesterol har vi introduceret tre kolesterollignende molekyler, hvor vi forstyrrer den hydrofobe-hydrofile balance i molekylet: en, hvor vi reducerer den hydrofobe halelængde (se Fig. 1C), hvor vi tilføjer en yderligere hydrofob gruppe (Fig. 1D), og en, hvor vi erstatter ringen med en simpel kæde (Fig. 1E).

Fig. 2 viser det beregnede temperatursammensætningsfasediagram for vand–phospholipid–kolesterolsystemet. Fasegrænserne blev opnået ved en visuel inspektion af snapshots og mere kvantitativt fra bøjningspunkterne for kurverne, der giver området pr. Disse egenskaber blev beregnet som en funktion af temperatur og kolesterolindhold.

lad os først fokusere på de rene lipidfaser, og effekten af kolesterol vil blive diskuteret næste. For det rene lipid-dobbeltlag er fasediagrammet beregnet af Kranenburg og Smit (14) for et system, der er fire gange mindre. Vi brugte den samme metode til at lokalisere fasegrænserne som Kranenburg og Smit gjorde (14). Vores resultater er i fremragende overensstemmelse med denne undersøgelse, hvilket indikerer, at de endelige størrelseseffekter er små. For det rene phospholipid observerer vi ved høje temperaturer en flydende fase (La), hvor halerne er uordnede. Ved lave temperaturer bestilles halerne og vippes, hvilket definerer gelfasen (L ‘ C). Disse to faser er adskilt af den ripplede fase (p ‘ krus), hvor vi observerer en mikrofaseseparation af domæner, hvor dobbeltlaget er tykt, og lipiderne er ordnet og domæner, hvor dobbeltlaget er tyndt og lipiderne forstyrret. Tilstedeværelsen af disse tre faser indikerer, at det resulterende fasediagram er i meget god overensstemmelse med det eksperimentelle diagram af det rene lipid (20). Temperaturskalaen indstilles ved at matche temperaturerne for faseovergange af gelfasen til rippelfasen (Tp) og rippelfasen til væskefasen (Tm) med de tilsvarende eksperimentelle faseovergangstemperaturer for ren DMPC. En yderligere sammenligning med de eksperimentelle data foretages for det gennemsnitlige areal pr. 3A), for dobbeltlagstykkelsen (Fig. 4A), og for lipid hale rækkefølge (Fig. 4B). For arealet pr. lipid opnår vi 56 liter 2 pr.molekyle sammenlignet med det eksperimentelle (21) 60 liter 2 pr. molekyle. For dobbeltlagstykkelsen beregnede vi en værdi på 38,7 liter, som sammenligner godt med den eksperimentelle værdi på 36 liter (21), og der opnås en lignende aftale for haleordren (se Fig. 4B). Molekyle for rent kolesterol simulerede vi et dobbeltlag af rent kolesterol. Vi opnåede en værdi på 40, 3 liter, hvilket sammenligner meget godt med den seneste eksperimentelle værdi på 41 Liter (22) for et monolag af kolesterol. I betragtning af tilnærmelserne i vores model er aftalen mellem de eksperimentelle og de simulerede værdier overraskende god.

lad os nu vende os til effekten af kolesterol på dobbeltlagets egenskaber. Det første spørgsmål, vi vil tage fat på, er, om vores model kan gengive kondensationseffekten. Fig. 3A viser effekten af kolesterol på området pr.molekyle som en funktion af kolesterolkoncentrationen. Sammenligning med de eksperimentelle data viser igen meget god enighed. I denne figur viser vi også området pr. molekyle under forudsætning af ideel blanding. Molekylet falder meget mere, end man ville forvente på basis af ideel blanding. Andre eksperimentelle data indbefatter virkningen af kolesterol på dobbeltlagssvulmen (Fig. 4A) og haleordreparameteren (Fig. 4B). Både de eksperimentelle data og simuleringen viser, at kolesterol øger tykkelsen af dobbeltlaget og dets rækkefølge. Også for disse to egenskaber er vores simuleringsresultater i meget god overensstemmelse med de eksperimentelle data. Simulerings-og forsøgsdata (Fig. 3a og 4 A og B) viser, at tilsætningen af kolesterol i høj grad ændrer egenskaberne af lipid-dobbeltlaget op til 30 mol-cholesterol. Herefter nås en region, hvor yderligere tilsætning af kolesterol kun har en lille effekt. Ved 30 mol% kolesterol har både området pr.molekyle og lipidhale rækkefølge og vippeparametre værdier, der er typiske for gelfasen.

farvekodningen i Fig. 2 viser forskellen mellem det simulerede areal pr.lipid og værdien estimeret ved at antage ideel blanding. Vi bemærker, at kondensationseffekten ved høje og lave temperaturer er relativt lille. Kondensationseffekten er maksimal i et veldefineret område i faserum, der er placeret lige over hovedfaseovergangen af det rene phospholipid. For bedre at forstå arten af kondensationseffekten er det vigtigt at forstå effekten af tilsætning af kolesterol på membranens faseadfærd.

Fig. 2 viser de vigtigste funktioner i fasediagrammet. De forskellige faser, vi observerede i vores simuleringer, er også blevet observeret eksperimentelt, skønt ikke altid for den specifikke blanding af DMPC og kolesterol (20, 23, 24). De forskellige eksperimentelle undersøgelser viser imidlertid kvalitativt meget forskellige fasediagrammer, hvilket begrænser vores muligheder for at foretage en detaljeret sammenligning. Snapshots af de forskellige faser kan findes i Fig. 5.

Ved meget høje temperaturer har tilsætningen af op til 50 mol% kolesterol ringe effekt på membranets struktur, og vi observerer La-fasen for alle koncentrationer (24). Ved temperaturer under Tp observerer vi, at kolesterol ændrer strukturen i gelfasen ved at hæmme hældningen af lipidhalerne, hvilket forårsager dannelsen af L ‘ C-fasen (20) (sammenlign Fig. 5 D med E). Ved højere kolesterolkoncentrationer (>20%) observerer vi dannelsen af små, kolesterolrige klynger. Vi betegner denne fase af LII, og denne fase er vist i Fig. 5E.ved temperaturer mellem Tp og Tm er det rene dobbeltlag i rippelfasen, og kolesterol transformerer denne rippelfase (se Fig. 5C) ind i en væskeordnet fase (23) (Fig. 5B). Udtrykket flydende ordnet fase blev introduceret af Ipsen et al. (25). Tykkelsen af dobbeltlaget er mellemliggende mellem tykkelsen af væsken og gelfasen. Lipidhaleordreparametrene har værdier, der er tæt på gelfasen; i modsætning til gelfasen er lipiderne imidlertid mere uordnede og vipper ikke. Kolesterol øger gradvist den temperatur, hvor La til Lo-faseovergangen finder sted. Ved meget høje kolesterolkoncentrationer omdannes den væskeordnede fase til en gelfase (LII), når temperaturen sænkes under Tm. Denne fase er blevet observeret eksperimentelt for dipalmitoylphosphatidylcholin (26), Men vi har ikke fundet eksperimentelle data for DMPC ved disse betingelser. Lad os nu vende tilbage til kondensationseffekten. Fig. 2 viser, at kondensationseffekten er maksimal ved en temperatur lige over hovedovergangen Tm. Årsagen er, at det rene dobbeltlag under disse forhold er i en væskeforstyrret tilstand, hvorimod tilsætningen af kolesterol til dobbeltlaget omdanner det til en væskeordnet fase, som har et areal pr. Denne store forskel forårsager en stor kondensationseffekt. Ved højere temperaturer forbliver væskefasen stabil for alle kolesterolkoncentrationer, hvilket giver en meget mindre kondensationseffekt. Ved lavere temperaturer har det rene lipid-dobbeltlag et areal pr. lipid, der er meget tættere på området pr.lipid i den væskeordnede fase, og som et resultat er kondensationseffekten langt mindre.

ovenstående resultater indikerer, at kondensationseffekten er en direkte konsekvens af særlige ændringer i den faseadfærd, som kolesterol inducerer. I litteraturen er der forskellige spekulationer om de aspekter af kolesterolstrukturen, der specifikt er ansvarlige for dens kondenserende virkning. For eksempel er paraplymodellen baseret på forestillingen om, at sammenlignet med phospholipider er den hydrofile del af kolesterol meget mindre og har brug for phospholipidet som en paraply til yderligere screening fra interaktioner med vand. Dette antyder, at en yderligere hydrofil gruppe ville ændre egenskaberne fuldstændigt. En anden vigtig faktor er den omfangsrige ringstruktur; hvis vi erstatter ringen med en hale, får vi et molekyle, der ligner mere et alkoholmolekyle (27). Imidlertid ville forkortelse af den hydrofobe hale have ringe effekt. Fig. 1 viser de modificerede kolesterolmolekyler, der efterligner disse ændringer. Faktisk er resultaterne i Fig. 3B viser, at forkortelse af halen af kolesterol viser den samme kondensationseffekt. Imidlertid, Fig. 3B viser, at for begge andre modifikationer af kolesterolmolekylet, tilsætning af en yderligere hydrofil gruppe og udskiftning af ringen med en lineær kæde, observeres ingen kondenserende virkning. Vi observerer den modsatte effekt: tilsætning af disse molekyler får dobbeltlaget til at blive mere udvidet sammenlignet med ideel blanding. Molekylet er blevet målt eksperimentelt, og de eksperimentelle data viser også en stigning (28). Tæt forbundet med dette observerede vi, at I begge tilfælde i fasediagrammet var væskefasen stabil over hele koncentrationsområdet. Faktisk observerer vi, at tilsætning af disse molekyler nedsætter hovedovergangstemperaturen, og derfor er der ingen region i fasediagrammet, hvor der er en stor kondensationseffekt.

simuleringer med disse strukturelle variationer af kolesterol indikerer, hvor overraskende subtil mekanismen er. Hovedovergangen i et rent dobbeltlag er meget følsomt over for de hydrofobe interaktioner. Hovedgrupperne af lipiderne screener de hydrofobe haler fra vandet. Lipid højt, og denne screening er langt fra optimal; men under disse forhold dominerer kædeentropien. Sænkning af temperaturen gør det stadig vigtigere at screene de hydrofobe interaktioner, og ved hovedovergangen inducerer i sidste ende en bestilling af kæderne. Et vigtigt aspekt er at forstå, hvordan kolesterol destabiliserer væskefasen. Kolesterol har et mindre hydrofilt hoved og er derfor mindre effektivt til at beskytte de hydrofobe interaktioner. Ved høje temperaturer kan lipid-dobbeltlaget rumme dette, men ved lavere temperaturer kan lipiderne kun bidrage til screeningen af kolesterolet ved at reducere dets areal pr. Dette medfører den observerede rækkefølge og forklarer, hvorfor hovedovergangen stiger. De to ændringer, vi introducerede til kolesterolstrukturen, påvirker dens hydrofobe screening; i begge varianter forsvinder den iboende undershielding af kolesterol. Hvis disse molekyler tilsættes til dobbeltlaget, er der ikke behov for yderligere screening af de hydrofobe interaktioner, og disse molekyler forhindrer dannelsen af en ordnet fase.

lad os sammenligne vores observationer med de tidligere modeller, der er blevet introduceret for at forklare kondensationseffekten. For det første giver vores model ingen indikation af langdistancebestilling, som det antages i superlattice-modellen. Implicit i både paraplymodellen og de kondenserede komplekser er antagelsen om en slags lokal organisation. For eksempel antages det i paraplymodellen, at et lipidmolekyle kunne screene et eller to nærliggende kolesterolmolekyler (se f.eks. 2). Vores simuleringer viser en meget mere uordnet struktur, hvor vi ikke kan identificere disse ordnede strukturer. På dette tidspunkt er det vigtigt at huske, at vores model indeholder mange antagelser, og dette rejser spørgsmålet om, hvorvidt de konklusioner, vi drager fra vores simuleringer, er relevante for de eksperimentelle systemer. Vi var meget overraskede over at se, at vi var i stand til at opnå en så rig faseadfærd ved at bruge en grovkornet model, der bruger rent frastødende kræfter. Vores model giver en meget rimelig kvantitativ beskrivelse af nylige eksperimentelle data om dobbeltlagets struktur. Det andet interessante aspekt er, at vores beregninger forudsiger, at kondensationseffekten er maksimal i et smalt temperaturområde over hovedovergangen. Det kan være muligt at verificere dette eksperimentelt. En meget streng test af vores model ville have været en detaljeret sammenligning med eksperimentfasediagrammet. I denne sammenhæng er det opmuntrende, at de faser, vi har fundet, er blevet observeret eksperimentelt, skønt ikke altid for nøjagtigt det simulerede system. Ved omhyggeligt at vælge de eksperimentelle data, der er enige med vores simuleringer, kunne vi endda hævde meget god aftale. En mulig årsag til uenigheden mellem de forskellige eksperimenter er, at forskellige teknikker anvendes, og ikke alle teknikker er lige så følsomme over for forskellene i strukturen i de forskellige faser. Vi håber, at kombinationen af et fasediagram og detaljerede oplysninger om strukturen i de forskellige faser giver nogle retningslinjer for, om en bestemt eksperimentel teknik kan identificere en bestemt faseovergang.