abstrakt
Bordetella pertussis blev diagnosticeret hos en human immundefektvirusinficeret patient ved en nyudviklet metode, hvor bakterielt DNA forstærkes direkte fra sputum Gram-farvede dias. Valideringen af metoden er beskrevet sammen med et yderligere nyt PCR-baseret assay, der kan skelne mellem B. pertussis og Bordetella holmesii.
identifikation af bakterier fra kliniske prøver udføres stort set via fænotypisk karakterisering efter in vitro-Kultur og mikroskopi. Ikke ualmindeligt, men direkte Gram-farvede præparater afslører mange organismer, men kulturer undlader at demonstrere et patogen. Dette blev illustreret i et nyligt klinisk tilfælde, hvor en 48-årig mand med AIDS blev indlagt med pulmonal coccidioidomycosis. På trods af antifungal behandling kunne hans status ikke forbedres. Sputumprøver afslørede mange gram-negative baciller ved direkte mikroskopi, men ingen patogener på kultur. Desuden voksede flere blodkulturer hurtige gram-negative stænger, som ikke kunne specificeres ved konventionelle metoder.
Vi besluttede at forsøge at identificere de to isolater ved genotypiske metoder ved anvendelse af universelle oligonukleotidprimere rettet mod det lille underenhed rRNA (16S rRNA) gen. Fra åndedrætsprøverne var der dog kun Gram-farvede dias tilgængelige. Vi udviklede derfor en ny metode, hvor bakterielt DNA udvindes direkte fra Det Gram-farvede objektglas. Slides blev Gram farvet ved traditionel metode (12). Et klart glasrutschebane blev smurt med prøver og behandlet med absolut methanol (Mallinckrodt, Hasseltræ, mo.), efterfulgt af varmefiksering ved 65 liter C og behandling med krystalviolet opløsning (Remel, Leneksa, Kans.). Diaset blev yderligere behandlet med Grams jod (Remel), affarvet med alkohol-acetoneopløsning (3:1) og modfarvet med safranin (Remel). Nedsænkningsolie blev først fjernet fra objektglasset med 100% kylen (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) efterfulgt af skylning i 100% ethanol. Derefter blev materialet skrottet med et lige barberblad, suspenderet i 50 liter Puregene-DNA hydratiseringsopløsning (Gentra, Minneapolis, minn.), hvirvlet og kogt i 10 min. Til analyse af blodisolatet blev der anvendt materiale fra både BACTEC-flasken og fra kolonier dyrket på fast medium. Efterfølgende PCR blev udført i et volumen på 50 liter indeholdende 5 liter af skabelonen, 1,5 mM MgCl2, 100 liter hver deoksynukleosidtriphosphat (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind.Roche Diagnostics Corporation) og 0,15 liter (hver) universal 16S rRNA primere 11E (5′-GAGGAAGGGGGATGACG-3′) og 13b (5′-TCCGGCCCCTTGCATAAGTG-3′) som beskrevet tidligere (15). Efter et denatureringstrin på 5 minutter ved 94 liter C blev PCR-trin på 94 liter C i 60 sekunder, 50 liter C i 60 sekunder og 72 liter C i 90 sekunder gentaget 30 gange i et Perkin-Elmer GeneAmp PCR-system 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Produkter blev opnået fra både sputum og blod (Fig. 1). Disse blev oprenset med PCR-rensningssætet., Valencia, Californien.), og DNA-sekventering blev udført på en anvendt Biosystems ABI3100-sekvensator (HHMI Biopolymer/M. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University School of Medicine). Efterfølgende sammenligning med den offentlige database (GenBank) ved BLAST (1) identificerede blodisolatet som Helicobacter cinaedi eller Helicobacter rappini. Begge organismer har været forbundet med bakteriemier hos immunkompromitterede patienter (9, 10, 13, 16, 17). PCR-produktet fra respiratorisk isolat matchede 16S rRNA-generne af både Bordetella pertussis og Bordetella holmesii, som er 99,5% homologe og identiske i det amplificerede område (18).
for at specialisere Bordetella respiratorisk isolat og validere resultatet af den genotypiske analyse blev der udviklet et diskriminerende assay, hvor en del af recA-genet (6, 7), som indeholder et unikt restriktionssted, blev målrettet. Forstærkning af B. pertussis (ATCC 9340; amerikansk Type Kultursamling, Manassas, Va.) og B. holmesii (ATCC 51541) DNA såvel som det fra vores patients sputumgramfarvning blev udført som beskrevet ovenfor, bortset fra at 3 mM MgCl2 og nydesignede specifikke primere (fremad, 5′-CAATACGCCTCCAAGCTGGG-3′; 5′-TGATGTCGAACTCGGCCTGC-3′) blev anvendt, og PCR-trinnene (94 liter C i 30 sekunder, 59 liter C i 30 sekunder og 72 liter C i 60 sekunder) blev gentaget 45 gange efterfulgt af et endeligt forlængelsestrin ved 72 liter C. produkterne blev fordøjet med NciI i henhold til producentens anbefalinger (Ny England Biolabs, Inc. Beverly, Masse.). De to organismer kunne let skelnes, fordi B. holmesii har to ncii-steder, mens B. pertussis og alle andre Bordetella spp. har kun et ncii-sted inden for det forstærkede område. Sputumisolatet blev efterfølgende identificeret som B. pertussis (Fig. 2) og er blevet rapporteret som et opportunistisk lungepatogen hos humane immundefektvirusinficerede patienter (4, 5).
Vi undersøgte derefter, om den genotypiske identifikation af organismer direkte fra kliniske Gram-pletpræparater med universelle primere er en gennemførlig og reproducerbar metode. Fikseringstypen (varme, 100% methanol og 100% ethanol) og tilstedeværelsen af farvestofrester efter gramfarvning som beskrevet ovenfor interfererer ikke med PCR. Der blev fundet en detektionsgrænse på 1.500 CFU/liter sputum (6 til 30 organismer pr.oliedypningsfelt), hvilket svarer til andre rapporter (14). Til dette fund blev tre tilfældige kliniske sputumprøver uden bakterier på Gram-plet eller i kultur samlet, tilsat definerede mængder Escherichia coli (ATCC 25922), FAST og Gram farvet og skrabet af objektglasset som beskrevet ovenfor. Flere tilfældigt udvalgte kliniske prøver blev testet, og når en dominerende organisme var synlig ved mikroskopi, matchede dens identifikation det dyrkede patogen (tabel 1).
vores metode har flere fordele i forhold til tidligere beskrevne analyser. I modsætning til tidligere rapporter, hvor DNA først ekstraheres fra sputum og artsspecifikke primere anvendes (2, 11, 14, 19, 20), vores assay bruger DNA udvundet direkte fra Gram-farvede dias uden ekstraktionstrin og bruger universelle primere, hvilket muliggør identifikation af en bred vifte af bakterier med en simpel protokol. Som vist kan dette opnås selv i nærvær af normal baggrundsbeboende flora, fordi antallet af PCR-cyklusser er begrænset, hvilket muliggør konkurrencedygtig amplifikation af bakterielt DNA. Da kvaliteten af den indsendte prøve og de relative andele af morfologisk forskellige mikrober let kan bestemmes på Gram-pletter, kan egnede udstrygninger vælges inden DNA-amplifikation. Derudover tjener Gram-pletudseendet af den dominerende organisme som en intern kvalitetskontrol efter genotypisk identifikation. Som med fænotypisk identifikation skal resultaterne af vores assay korreleres med det kliniske billede, før behandlingsbeslutninger træffes, da ingen af metoderne pålideligt kan skelne mellem kolonisering og infektion.
blandt de få rapporter i den engelsksprogede litteratur, der beskriver genopretning af nukleinsyre fra kliniske prøver på glasrutschebaner (3, 8), har ingen hidtil beskrevet DNA-amplifikation efter genopretning af bakterier fra Gram-farvede dias. Vores metode er hurtig og pålidelig og kan bruges som et værktøj i tilfælde, hvor organismer ses i overflod på kliniske Gram-farvede dias, men ikke kan genvindes i kultur. Teknikken kan være særlig nyttig, når der søges en diagnose med tilbagevirkende kraft, eller efter at de originale prøver er blevet kasseret.
16S rRNA DNA-amplifikation resultater. E. coli (ATCC 25922 Bane 1), Campylobacter jejuni (ATCC 33291, Bane 2) og Staphylococcus aureus (ATCC 25923, Bane 3 og 4) blev brugt som kontroller. Bakterielt DNA fra patientens blod blev forstærket fra BACTEC-flasken (bane 5), fra en pladekoloni (bane 6) og fra Gram-farvede åndedrætsprøver (BAL, bane 7; sputumprøver, bane 8 og 9). DNA blev også genvundet fra en kontrolprøve (bane 4) efter gramfarvning og skrabning. Bane 10 indeholdt vand, og bane M indeholdt molekylære størrelsesmarkører (phiks174-HaeIII; Ny England Biolabs, Inc. Beverly, Masse.). PCR-produkter (216 bp) blev visualiseret ved agarosegelelektroforese (3% agarosegel; 1:2 Seakem LE agarose-Nusieve GTG-agarose; FMC Bioproducts, Rockland, Maine) og DNA-farvning med ethidiumbromid. Sekvenser opnået med universal primer PCR blev bekræftet for alle kontrolstammer.
differentiering mellem B. pertussis og B. holmesii ved recA-genforstærkning efterfulgt af fordøjelse med NciI. Det forstærkede segment af Bordetella recA-genet (483 bp) resulterede i fragmenter af følgende størrelser efter ncii-fordøjelse: B. pertussis, 295 og 188 bp; og B. holmesii, 188, 156 og 139 BP. Baner: m, molekylære størrelsesmarkører (i basepar) (phiks174-HaeIII; Ny England Biolabs Inc.); 1, B. holmesii (ATCC-stamme, uklippet); 2, B. pertussis (ATCC-stamme, pladekoloni); 3, B. holmesii (ATCC-stamme, pladekoloni); 4, B. pertussis (ATCC-stamme blandet med sputum, Gram farvet); 5, B. holmesii (ATCC-stamme blandet med sputum, Gram farvet); 6, patientens sputum Gram-farvet prøve. Se legenden til Fig. 1 For en beskrivelse af gelelektroforese.
- se inline
- se popup
analyse af kliniske sputum-og sårprøver
anerkendelser
Vi takker personalet på det kliniske Mikrobiologilaboratorium på Yale ny Haven Hospital, især Linda L. Post og Vincent Piscitelli, for uvurderlig hjælp og støtte.
fodnoter
- i:HVP=”http://schema.highwire.org/Journal modtaget 16.juni 2003.i=”http://schema.highwire.org/Journal returneret til ændring 10.September 2003.”http://schema.highwire.org/Journal accepteret 11.November 2003.
- Copyright 2004 American Society for Microbiology
- 1.han er en af de mest kendte og mest kendte mennesker i verden.1990. Grundlæggende lokal tilpasning søgeværktøj. J. Mol. Biol.215:403-410.