Jackson begyndte at optræde i en lille rolle i filmen Crooked Hearts i 1991. Det næste år spillede han rollen som Charlie i en musikalsk version af Chocolate Factory. På dette tidspunkt, med hjælp fra stykkets casting direktør Laura Kennedy, han sluttede sig til agenturet. Kort efter landede han rollen som Charlie (#96) i Mighty Ducks-serien, spiller en ung og håbefuld hockeyspiller.Joshua Jackson fortsatte med at optræde som Pacey på Daysons Creek, som blev oprettet af Kevin og løb på netværket fra 1998 til 2003, og spillede også hovedrollen James Van Der Beek, Michelle Vilhelms og Katie Holmes. Mens forestillingen var på pause, optrådte han i flere film, herunder Cruel Intentions (en ny York yuppie tilpasning af Les Liaisons dangereuses der også medvirkede Sarah Michelle Gellar og Ryan Phillippe), kranierne, objekternes sikkerhed, Laramie-projektet og en kort komo i genindspilningen af Ocean ‘ s Eleven hvor han optræder som sig selv i en pokerscene med blandt andet Brad Pitt, George Clooney og Holly Marie Combs. I 2000 gæstestjernede han også i Sæson 12 af The Simpsons, der udtrykker karakteren af Jesse Grass, en “hunky miljøforkæmper” og elsker interesse for Lisa Simpson i episoden “Lisa The Tree Hugger”. Han blev også kastet som” Beau ” i filmen sladder i 2000 med skuespillerne James Marsden, Kate Hudson og Norman Reedus.kort efter Daysons Creek sluttede i 2003, spillede Jackson hovedrollen i film sammen med Dennis Hopper (Americano), Harvey Keitel (skygger i solen) og Donald Sutherland (Aurora Borealis). I 2005 flyttede Jackson til Storbritannien og debuterede på scenen i London Vest ende med Patrick Stuart i David Mamet ‘ s to-mands spil, Et liv i teatret. Stykket var en kritisk og populær succes og løb fra februar til April samme år. Jackson sagde, at han ville overveje at vende tilbage til scenen for at prøve sin hånd på scenen. Hans næste filmrolle var i Bobby, instrueret af Emilio Esteves, Jacksons co-star fra The Mighty Ducks. Han spillede en hovedrolle i Shutter, en amerikansk genindspilning af en thailandsk gyserfilm med samme navn. Han medvirkede og fungerede som udøvende producent i den canadiske uafhængige film en uge, der åbnede den 6.marts 2009.
fra 2008 til 2013 spillede Jackson hovedrollen som Peter Bishop i science-fiction-serien Fringe, skabt af JJ Abrams, Roberto Orci og Aleks Kurtsman. Serien optrådte på ræv TV-netværk og var den næsthøjest bedømte nye serie i sæsonen 2008-2009 efter CBS ‘ s mentalisten. BuddyTV rangerede ham #9 på sin” TV ‘s 100 mest kønnede mænd i 2010″ liste, #19 i 2011 og #14 i 2012.
Jackson blev nomineret til Genie-prisen for Bedste præstation af en skuespiller i en ledende rolle for filmen en uge. Han vandt prisen den 12. April 2010. Han holdt og var vært for den satiriske Pacey-Con i 2010, direkte på tværs af gaden fra San Diego Comic-Con, sporting en fodboldtrøje og give ud fan fiction, skrevet af Daysons Creek fans, til dem, der venter i Comic-Con indgang linje. Optagelser af begivenheden blev optaget til en video med titlen ‘Pacey-Con’, som han filmede til Vil Ferrells Funny Or Die celebrity humor hjemmeside. I 2013 optrådte Jackson i IFC-filmen uundgåelig med Marisa Tomei og Aleksandr Siddig. Jackson skrev den første historie fra tegneserietrilogien Beyond the Fringe med titlen “Peter and the Machine”. Jackson medvirkede i den succesfulde tv-serie, The Affair, hvor han spillede Cole Lockhart, hovedpersonen mand til den utrolige Alison Lockhart.i Marts 2018 fik Jackson sin teaterdebut på Children of a Lesser God, hvor han spillede James Leeds, en ukonventionel lærer i skolen for døve, der kommer i et konfliktfuldt professionelt og romantisk forhold med en tidligere døve studerende, Sarah Norman (Lauren Ridloff). Stykket løb gennem maj 2018.i 2019 medvirkede Jackson som forsvarsadvokat Mickey Joseph i drama-miniserien, når de ser os.i 2020 medvirkede Jackson i Hulus miniserie Little Fires overalt baseret på romanen af Celeste Ng.
Jackson er blevet kastet i titelrollen i Dr. Death, baseret på podcasten med samme navn.