din rådgiver fortæller dig, at han vil have dig til at bruge HPLC til at analysere din forbindelse. Du ved, at du har hørt om denne teknik før, men du kan ikke huske, hvad HPLC står for, endsige hvordan man gør det! Vi har alle været der, og jeg vedder på, at du ville ønske, at du havde været mere opmærksom på det foredrag!Frygt ikke-i denne serie af artikler vil jeg minde dig om kraften i HPLC-kolonnen Krish
i denne første artikel vil jeg tage dig gennem princippet bag HPLC og minde dig om dets anvendelser – du vil være klar til laboratoriet på ingen tid!
Hvordan virker HPLC?
højtydende væskekromatografi eller HPLC er et langt navn for en kraftig teknik baseret på den simple kendsgerning, at individuelle forbindelser opfører sig forskelligt i vand.
HPLC adskiller og renser forbindelser i henhold til deres polaritet eller deres tendens til at lide eller ikke lide vand. For at sætte polaritet i sammenhæng skal du overveje, at olie er en apolær væske, der ikke blandes med vand. Ethanol er derimod polar, og som mange af jer ved, blandes meget godt med vand (Vodka og koks nogen??).
Jeg har forsøgt at forenkle hele processen i Figur 1 nedenfor, men lad os først se på hovedkomponenterne involveret i HPLC. Undskyld på forhånd for nogle uundgåelige jargon!
komponenterne
HPLC-kolonnen
Dette er også kendt som den stationære fase. Dette er HPLC-maskinens arbejdshest, er lavet af et af forskellige stoffer (ofte silica) og er meget kompakt. Silicapartiklerne funktionaliseres af lange carbonkæder. Carbonkæderne er apolære, og jo længere kæden er, desto mere apolær bliver søjlen. Kolonner indeholdende 18-carbon kæder er almindeligt anvendt og er kendt som C18 kolonner.
HPLC-prøven
prøvetyper varierer meget afhængigt af feltet og typen af forbindelser. HPLC kan bruges til at analysere forbindelser i biologiske prøver (urin, blod, spyt og muskler), miljøprøver, medicinsk kemi (lægemidler) og mikrobiologi (toksiner produceret af svampe og bakterier).
injektion af prøve
prøver injiceres i HPLC-kolonnen. Dette blev tidligere udført manuelt, hvilket betyder, at en fattig sjæl måtte sidde ved HPLC-maskinen i timevis og injicere hver prøve med en sprøjte, nogle gange hele natten lang!
heldigvis har nyere modeller en automatisk injektor, hvilket reducerer den manuelle indgang og tillader højere gennemstrømning. Moderne maskiner er udstyret med programmer, der giver brugeren mulighed for at indtaste en liste over prøver, hvor meget og i hvilken rækkefølge de skal injiceres. Så du kan nyde din frokost, mens din HPLC kører selv!
den mobile fase
Dette er egentlig bare en blanding af vand og et organisk opløsningsmiddel (normalt acetonitril eller methanol). Den mobile fase får det navn, fordi den bevæger sig gennem søjlen og samtidig eluerer (eller skyller ud) forbindelserne fra søjlen.
forbindelser elueres ofte langs en koncentrationsgradient. Hvis du er noget som mig, koncentration og gradient er to ord, du hader at se komme sammen i en sætning! Det betyder bare, at procentdelen af vand i den mobile fase falder over tid, mens procentdelen af det apolære opløsningsmiddel stiger samtidigt. Det betyder, at mobilfasen gradvist bliver mere apolær. Du skal ikke bekymre dig for meget om gradienter for nu, da de vises igen i en opfølgningsartikel.
HPLC-kørslen
HPLC kan udføres i en række tilstande. Den mest anvendte metode er kendt som omvendt fase (RP-HPLC), og det er det, jeg beskriver her. I denne tilstand adskilles forbindelser startende med de mest polære og slutter med de apolære forbindelser. For alle tilstande bevæger en højdrevet pumpe prøven og mobilfasen gennem søjlen. Et typisk løb kan tage mellem 10-60 minutter.
princippet bag HPLC – et nærmere kig
nu hvor du har en ide om de involverede komponenter, lad os gå videre til princippet lidt mere detaljeret.
jeg nævnte ovenfor, at HPLC adskiller forbindelser på basis af polaritet. Men hvordan fungerer dette faktisk? Engelsk please! Når gradienten sparker ind, øges opløsningsmiddelkoncentrationen, mens vandkoncentrationen falder. Dette gør den mobile fase mere og mere apolær. Forbindelser indeholdt i prøven klæber til kulstofkæderne i søjlen, hvor de mest apolære forbindelser klæber de stærkeste, og de mest polære forbindelser klæber svagt.
Figur 1 viser, hvad der sker med en prøve, der indeholder en blanding af forbindelser efter injektion i søjlen. Forbindelserne binder til søjlen og skylles ud på forskellige tidspunkter, afhængigt af om de er mere tilbøjelige til at holde sig til søjlen eller den mobile fase, når den pumpes igennem. Den tid, som hver forbindelse eluerer (eller skyller ud) fra søjlen, er kendt som forbindelsens retentionstid (Rf).
Figur 1: princippet bag HPLC
Figur 1: forbindelser med forskellige polariteter (angivet som mørkere nuancer af blå) injiceres i HPLC-søjlen (hele cylinderen). Den mobile fase pumpes gennem søjlen, og tilsætningen af opløsningsmiddel langs en koncentrationsgradient (vist som en sort prikket linje) reducerer kontinuerligt den samlede polaritet i den mobile fase (Y-akse). Forbindelser er i stand til at holde sig til enten kolonnen eller den mobile fase, afhængigt af hvor polære de er. Forbindelser vil til sidst holde sig til den mobile fase, når deres polaritet svarer til den mobile fase. De adskiller sig derefter fra søjlen og elueres på et bestemt tidspunkt (h-akse) under løbet. Denne gang er kendt som Rf for denne forbindelse.
forståelse af output
output eller resultater af en HPLC-kørsel ses normalt som et kromatogram (figur 2). Dette er en vandret række toppe, der repræsenterer forbindelser elueret fra søjlen med forskellige Rf-værdier. Moderne HPLC-udstyr kobles ofte til en diode array detektor (DAD), så brugeren kan se på det resulterende kromatogram af adskilte forbindelser i bølgelængder fra 190 nm til 900 nm. Hvis de undersøgte forbindelser er kendt, kan brugeren kun vælge at se på 1 eller et par udvalgte bølgelængder. For eksempel kan kokain observeres ved 254 nm.
figur 2: et typisk HPLC-kromatogram
figur 2: Dette kromatogram viser adskillelsen af forbindelser fra en kemisk reaktion, og kromatogrammet ses ved 254 nm. To hovedtoppe forekommer ved 8,20 og 9 minutter, hvilket repræsenterer to forbindelser med disse retentionstider. Antallet af absorbansenheder (AU) vises på Y-aksen, mens køretiden vises på H-aksen.
applikationer
inden for biologi og medicin bruges HPLC ofte som et analytisk værktøj til at analysere biologiske og miljømæssige prøver for tilstedeværelse eller fravær af kendte forbindelser (for eksempel metabolitter, medikamenter, toksiner, pesticider) og kan hjælpe med at identificere ukendte forbindelser.
inden for kemi bruges HPLC imidlertid rutinemæssigt til at overvåge kemiske reaktioner såvel som til at bestemme produkternes renhed. Derudover kan HPLC-processen modificeres til præparativ HPLC, hvorved forbindelser af interesse kan renses til videre anvendelse.
HPLC kan komme på tværs af at være meget kompliceret til at begynde med, men vær sikker på, ligesom de fleste andre laboratorieteknikker, det giver meget mere mening, når du rent faktisk gør det.
Hold øje med mine opfølgende artikler i de kommende uger, hvor jeg vil gennemgå nogle tip til, hvordan du kan få det bedste ud af din HPLC-kørsel afhængigt af dit forskningsmål, samt diskutere objektivt, hvordan HPLC kan bruges inden for din forskning.
er der andre aspekter af denne teknik, du gerne vil have dækket mere detaljeret? I så fald vil vi meget gerne høre fra dig!
glad HPLC-ing Kris
har dette hjulpet dig? Så del venligst med dit netværk.