højtydende væskekromatografi massespektrometri er en yderst alsidig instrumental teknik, hvis rødder ligger i anvendelsen af mere traditionel væskekromatografi til teorier og instrumentering, der oprindeligt blev udviklet til gaskromatografi (GC). Som navnet antyder, omfatter instrumenteringen en højtydende væskekromatograf (HPLC), der via en passende grænseflade er fastgjort til et massespektrometer (MS). Den primære fordel HPLC/MS har over GC/MS er, at det er i stand til at analysere et meget bredere udvalg af komponenter. Forbindelser, der er termisk labile, udviser høj polaritet eller har en høj molekylvægt, kan alle analyseres ved hjælp af HPLC/MS, selv proteiner kan rutinemæssigt analyseres. Opløsninger afledt af prøver af interesse injiceres på en HPLC-søjle, der omfatter et smalt rustfrit stålrør (normalt 150 mm længde og 2 mm indvendig diameter eller mindre) pakket med fine, kemisk modificerede silicapartikler. Forbindelser adskilles på basis af deres relative interaktion med den kemiske belægning af disse partikler (stationær fase) og opløsningsmidlet eluerer gennem søjlen (mobil fase). Komponenter, der eluerer fra den kromatografiske søjle, introduceres derefter til massespektrometeret via en specialiseret grænseflade. De to mest almindelige grænseflader, der anvendes til HPLC/MS, er elektrosprayionisering og kemisk ioniseringsgrænseflader med atmosfærisk tryk.
Elektrosprayionisering
Ved elektrosprayionisering introduceres analytten til kilden ved strømningshastigheder typisk i størrelsesordenen 1 liter min-1. Analytopløsningsstrømmen passerer gennem elektrospraynålen, der har en høj potentialeforskel (i forhold til tællerelektroden) påført den (typisk i området fra 2,5 til 4 kV). Dette tvinger sprøjtningen af ladede dråber fra nålen med en overfladeopladning med samme polaritet til ladningen på nålen. Dråberne afstødes fra nålen mod kildeudtagningskeglen på tællerelektroden (vist med blåt). Når dråberne krydser mellemrummet mellem nålespidsen og keglen, forekommer fordampning af opløsningsmiddel. Dette er cirklet på Fig.1 og udvidet i Fig.2. Når opløsningsmiddelfordampningen opstår, krymper dråben, indtil den når det punkt, at overfladespændingen ikke længere kan opretholde ladningen (Rayleigh-grænsen), på hvilket tidspunkt en “Coulombisk eksplosion” opstår, og dråben rives fra hinanden. Dette producerer mindre dråber, der kan gentage processen såvel som nøgne ladede analytmolekyler. Disse ladede analytmolekyler (de er ikke strengt ioner) kan enkeltvis eller multipliceres ladet. Dette er en meget blød metode til ionisering, da meget lidt restenergi bevares af analytten ved ionisering. Det er genereringen af multipliceret ladede molekyler, der gør det muligt at analysere komponenter med høj molekylvægt, såsom proteiner, da massespektrometerets masseområde øges kraftigt, da det faktisk måler forholdet mellem masse og ladning snarere end masse i sig selv. Den største ulempe ved teknikken er, at der produceres meget lidt (normalt ingen) fragmentering, selvom dette kan overvindes ved brug af tandem-massespektrometriske teknikker såsom MS/MS eller MSN.
Figur 1 en skematisk af en ESI-grænseflade
figur 2 en skematisk af mekanismen for iondannelse
atmosfærisk tryk kemisk ionisering
atmosfærisk tryk kemisk ionisering ionisering (apci) er en analog ioniseringsmetode til kemisk ionisering (ci). Den signifikante forskel er, at APCI forekommer ved atmosfærisk tryk og har sine primære anvendelser inden for ionisering af forbindelser med lav masse (APCI er ikke egnet til analyse af termisk labile forbindelser). Den generelle kildeopsætning (se Fig. 3) deler en stærk lighed med ESI. Hvor APCI adskiller sig fra ESI, er i den måde ionisering forekommer. I ESI købes ionisering gennem den potentielle forskel mellem sprøjtenålen og keglen sammen med hurtig, men blid øde. I APCI indføres analytopløsningen i en pneumatisk forstøver og øde i et opvarmet kvartsrør, inden den interagerer med koronaudladningen, der skaber ioner. Koronaudladningen erstatter elektronfilamentet i CI – atmosfæretrykket ville hurtigt “brænde ud” alle filamenter – og producerer primær N2-Kurt+ og N4-Kurt+ ved elektronionisering. Disse primære ioner kolliderer med de fordampede opløsningsmiddelmolekyler til dannelse af sekundære reaktantgasioner – f.eks. H3O+ og (H2O)nH+ (se Fig. 4). Disse reaktante gasioner gennemgår derefter gentagne kollisioner med analytten, hvilket resulterer i dannelsen af analytioner. Den høje frekvens af kollisioner resulterer i en høj ioniseringseffektivitet og termalisering af analyteionerne. Dette resulterer i spektre af overvejende molekylære arter og adduktioner med meget lidt fragmentering. Når ionerne er dannet, går de ind i pumpe-og fokuseringsfasen i stort set det samme som ESI.
figur 3 en skematisk af komponenterne i en APCI-kilde
figur 4 en mere detaljeret visning af mekanismen for APCI
diagrammer og tekst (delvis) af Dr. Paul Gates, skole af kemi, University of Bristol