i 1970 ‘ erne blev mest væskekromatografi udført under anvendelse af en fast understøttende stationær fase (også kaldet en søjle) indeholdende umodificeret silica eller aluminaharpikser. Denne type teknik kaldes nu normalfasekromatografi. Da den stationære fase er hydrofil i denne teknik, vil molekyler med hydrofile egenskaber indeholdt i den mobile fase have en høj affinitet for den stationære fase og vil derfor adsorbere til søjlepakningen. Hydrofobe molekyler oplever mindre affinitet for søjlepakningen og vil passere igennem for at blive elueret og detekteret først. Eluering af de hydrofile molekyler adsorberet til søjlepakningen kræver anvendelse af mere hydrofile eller flere polære opløsningsmidler i den mobile fase for at skifte fordelingen af partiklerne i den stationære fase mod den mobile fase.
omvendt fasekromatografi er en teknik, der bruger alkylkæder kovalent bundet til de stationære fasepartikler for at skabe en hydrofob stationær fase, som har en stærkere affinitet for hydrofobe eller mindre polære forbindelser. Anvendelsen af en hydrofob stationær fase er i det væsentlige det modsatte af normal fasekromatografi, da polariteten af de mobile og stationære faser er blevet omvendt – deraf udtrykket omvendt fasekromatografi. Omvendt fasekromatografi anvender en polær (vandig) mobil fase. Som et resultat har hydrofobe molekyler i den polære mobile fase tendens til at adsorbere til den hydrofobe stationære fase, og hydrofile molekyler i den mobile fase vil passere gennem søjlen og elueres først. Hydrofobe molekyler kan elueres fra søjlen ved at reducere polariteten i den mobile fase ved hjælp af et organisk (ikke-polært) opløsningsmiddel, hvilket reducerer hydrofobe interaktioner. Jo mere hydrofob molekylet er, desto stærkere vil det binde til den stationære fase, og jo højere er koncentrationen af organisk opløsningsmiddel, der kræves for at eluere molekylet.
mange af de matematiske og eksperimentelle overvejelser, der anvendes i andre kromatografiske metoder, gælder også for RPC (for eksempel er separationsopløsningen afhængig af kolonnens længde). Det kan bruges til adskillelse af en lang række molekyler. Det bruges typisk ikke til adskillelse af proteiner, fordi de organiske opløsningsmidler, der anvendes i RPC, kan denaturere mange proteiner. Af denne grund anvendes normal fasekromatografi mere almindeligt til adskillelse af proteiner. Imidlertid kan denatureringen af proteiner faktisk være gavnlig i den senere analyse af prøverne opnået fra kromatografien. Hvis der foretages en fordøjelse med trypsin på de analyserede proteiner, er lineariseret protein mere egnet til dette. Derfor kan denaturering af proteiner ved anvendelse af passende opløsningsmidler, der forårsager udfoldelsen af proteinerne, faktisk være forsætlig, før den fraktionerede prøve tages gennem massespektrometri.
i dag er RPC en hyppigt anvendt analytisk teknik. Der er en række stationære faser til rådighed til brug i RPC, hvilket giver stor fleksibilitet i udviklingen af separationsmetoder.
Silicabaseret stationær faseredit
ethvert inert polært stof, der opnår tilstrækkelig pakning, kan anvendes til omvendt fasekromatografi. Den mest populære kolonne er en octadecyl carbon chain (C18)-bundet silica (USP klassificering L1). Dette efterfølges af C8-bundet silica (L7), ren silica (L3), cyanobundet silica (L10) og phenylbundet silica (L11). Bemærk, at C18, C8 og phenyl er dedikerede omvendte faseharpikser, mens cyano-søjler kan bruges i en omvendt fasetilstand afhængigt af analyt-og mobilfasebetingelser. Ikke alle C18-kolonner har identiske fastholdelsesegenskaber. Overfladefunktionalisering af silica kan udføres i en monomer eller en polymer reaktion med forskellige kortkædede organosilaner, der anvendes i et andet trin til at dække resterende silanolgrupper (endeafdækning). Mens den samlede retentionsmekanisme forbliver den samme, vil subtile forskelle i overfladekemikalierne i forskellige stationære faser føre til ændringer i selektivitet.
moderne kolonner har forskellig polaritet. PfP er pentafluorphenyl. CN er cyano. NH2 er amino. ODS er octadecyl eller C18. ODCN er en kolonne med blandet tilstand bestående af C18 og nitril. Kationisk udveksling (anvendes til adskillelse af organiske aminer). Sac er en stærk anionisk udveksling (anvendes til separation af carboksilsyreforbindelser).