abstrakt
hårsækken er et hudintegument ved grænsen mellem en organisme og dens umiddelbare miljø. Den menneskelige hårfollikels biologiske rolle har mistet noget af sin forfædres betydning. En dybdegående undersøgelse af denne miniorgan afslører imidlertid skjult kompleksitet med stort forskningspotentiale. En væsentlig overvejelse, når man beskæftiger sig med menneskelig forskning, er bevidstheden om potentiel skade og dermed det absolutte behov for ikke at skade—en regel, der er passende kvalificeret med det latinske udtryk “primum non nocere” (først gør ingen skade). Den plukkede håraksel giver sådanne fordele. Brugen af stamceller, der findes i hårsækkeceller, får fart inden for Regenerativ Medicin. Desuden inkluderer nuværende diagnostiske og kliniske anvendelser af plukkede hårsække deres anvendelse som autologe og/eller tredimensionelle epidermale ækvivalenter sammen med deres anvendelse som surrogatvæv i farmakokinetiske og farmakodynamiske undersøgelser. Derfor kan brugen af ikke-invasive diagnostiske procedurer på hårsækkeaksler, der udgør en surrogatmolekylær model for indre organer i den enkelte patient for et spektrum af humane sygdomsbetingelser, muligvis blive en realitet i den nærmeste fremtid.
1. Indledning
hårsækken er et hudintegument ved grænsen mellem en organisme og dens umiddelbare miljø. Det er den evolutionære slægtning til skalaen, fjer, og negle, integumenter, der har tjent en væsentlig rolle i organismernes overlevelse . Den menneskelige hårfollikels biologiske rolle har mistet noget af sin forfædres Betydning; en dybdegående undersøgelse af denne miniorgan afslører imidlertid skjult kompleksitet med et enormt forskningspotentiale. Forfatterne beskriver hårsækken som havende en unik pattedyrskarakteristik med et stamcellerigt, prototypisk neuroektodermalt-mesodermalt interaktionssystem. Det beskrives som et pattedyrorgan, der gennemgår cykliske transformationer fra stadier af hurtig vækst (anagen) til apoptosedrevet regression (catagen) og tilbage til anagen via en blandet periode med relativ ro (telogen), der vedvarer gennem dyrets levetid .
denne miniorgan er blevet undersøgt både in vitro og in vivo hos dyr og mennesker. Enhver tilgang har fordele og ulemper, men der er ingen tvivl om, at menneskelig forskning, der tillader minimal indblanding, giver meget relevante resultater. En væsentlig overvejelse, når man beskæftiger sig med menneskelig forskning, er bevidstheden om potentiel skade og dermed det absolutte behov for ikke at skade en regel, der er passende kvalificeret med det latinske udtryk “primum non nocere” (først gør ingen skade). Den plukkede håraksel giver sådanne fordele.
hårskakter er almindelige, små og let opnåelige uden et stort ubehag for den enkelte, der deltager i forskningen. Håraksler repræsenterer menneskeligt væv, der kan samples over forskellige tidspunkter. Denne miniorgan har både neuroektodermal og mesodermal oprindelse samt fungerer som en kilde til stamceller. Dette papir vil primært fokusere på brugen af den plukkede hårskaft til menneskelig medicinsk forskning og dets nye potentiale.
2. Plukket Hårakselanatomi og integritet
den intakte hårsæk (se figur 1) kan simpelthen beskrives ud fra et histologisk synspunkt som en minutklynge af ensartede epitelceller, der støder op til en lignende størrelse aggregering af ensartede mesenkymale celler. Det er et organ sammensat af fem eller seks koncentriske cylindre, der hver består af celler af en karakteristisk type, der syntetiserer deres eget karakteristiske sæt proteiner . En detaljeret biologi af den intakte hårfollikel findes i artiklen udgivet af Paus og Cotsarelis .
opnåelse af en intakt hårfollikel er kun mulig ved hjælp af en hudbiopsi. Denne invasive procedure begrænser tilgængeligheden, hovedsageligt til væv opnået under andre kirurgiske procedurer, såsom hudoverskuddet opnået under ansigtsløftningskirurgi og prøver opnået under hårtransplantationsprocedurer. Plukning af håraksler er en alternativ, mindre invasiv teknik. Der er imidlertid spørgsmålet om, hvor mange celler der kommer op med follikelens oprotning, og hvilke typer celler der kommer ud med en sådan metode.
selvom den plukkede hårskaft er klart ringere i cellulær mængde og kompleksitet til en intakt hårfollikel som opnået ved en biopsi, bærer den tilstrækkelig cellulær masse til at tillade detaljerede videnskabelige undersøgelser. Moll anvendte den plukkede hårsæk til at identificere regioner med det største vækstpotentiale i kultur samt analysere genekspression og proteinanalyser i de forskellige segmenter af de plukkede follikler .når man sammenligner farvede hårsække fra hudbiopsier og plukkede hår ved hjælp af lysmikroskopi, demonstrerede Gho og kolleger, at de fleste af epitelstrukturerne fra hårsækken forbliver fastgjort til det plukkede hår . Opretholdelsen af integriteten af det ydre rodark efter hårplukning er et muligt resultat og er dokumenteret af Limat og kolleger . Plukning af hårsækkene tillader undersøgelse af pigmentceller, en tilgang, der blev foretaget i 1950 ‘ erne af Barnicot og kolleger, der var blandt de første til at studere den plukkede håraksel under elektronmikroskopi . Human anagen hovedbund hårpærer blev undersøgt ved lysmikroskopi for at undersøge de anatomiske virkninger af mekanisk plukning . Interessant nok viste undersøgelsen, at anagen hårpærer rives af i reproducerbare mønstre . Bortset fra den “typiske” pause, der konisk omgiver den dermale papilla, beskriver forfatterne også fire yderligere brudformer : (1)brud på håret omkring den øverste tredjedel af papillen, hvilket resulterer i dysplastiske anagenhår i trichogrammet, (2)brud på håret langt over den dermale papilla, hvilket resulterer i “ødelagte” anagenhår, (3)total fjernelse af det proksimale follikelepitel med fjernelse af den dermale papilla, hvilket resulterer i såkaldte papillahår i trichogrammet ;(4)den anden virkning af plukning på hårsækken er ændringen af den mesenkymale kappe, hvilket giver anledning til blødninger og ødem, der øger volumenet af både den dermale papilla og den underliggende “papilla pude” af Pinkus.
pausetyperne beskrevet af Bassukas og Horstein skyldes muligvis enten upassende plukketeknikker eller på grund af de forskellige underfaser i anagenstadiet . et system til iscenesættelse af plukkede håraksler er blevet beskrevet af Camidge og kolleger i deres papir om brugen af plukket menneskehår som et væv, der kan bruges til at vurdere de farmakodynamiske endepunkter under lægemiddeludviklingsundersøgelser . Hår blev undersøgt ved lysmikroskopi for at evaluere nuklear farvning med hensyn til dets tilstedeværelse/fravær, farvningsstedet og hårstadiet . Hvert hår med en synlig pære og rodkappe blev fotograferet og iscenesat (0, 1, 2 eller 3) i henhold til et skræddersyet system baseret på afstanden til den nedre kant af kappen fra bunden af pæren .
Trin 0 blev defineret som kappe, der omfattede pæren, trin 1 < 150 liter, trin 2 = 150-699 liter og trin 3 > 700 liter. Hår, der bemærkes at være uden synlige pærer og skeder, der ikke tidligere var udelukket ved den første øjenundersøgelse, blev kasseret .
de ovenfor beskrevne undersøgelser har lagt grundlaget for en reproducerbar videnskabelig klassificering af plukkede hårsække i betragtning af den mulige forskellige virkning af plukning på histologien i det undersøgte væv.
3. Stamceller og plukkede hårskakter
epidermis har to stamcellelagre, den ene findes i det basale lag af interfollikulær epidermis og den anden i hårsækken. Brugen af stamceller, der findes i hårsækkeceller, får fart inden for Regenerativ Medicin. Dette har skabt behovet for at identificere det nøjagtige sted i hårsækken og at designe enkle metoder til at få adgang til sådanne celler, såsom fra plukkede hårsække, der er let tilgængelige.
Moll udførte undersøgelser af lokalisering af kolonidannende celler i humane plukkede håraksler . Efterforskerne brugte anagen hovedbund plukkede hår for at bekræfte tilstedeværelsen af et intakt ydre rodark såvel som det proliferative potentiale for de forskellige keratinocytter . For at opnå lokalisering blev fem segmenter af den ydre rodkappe (ORS), B1, B2, B3-1, B3-2 og B4 afgrænset ved hjælp af mikrodissektion. Det blev fundet, at kolonidannende evne for det meste var markeret i mellemdelen (B2) og den nedre halvdel af den centrale del (B3-1) . Den længste in vitro levetid blev fundet i fragmentet B3-2 og den korteste i fragmentet B1 (pære) . Da cellerne med høj kolonidannende evne lokaliseret i de nedre centrale dele af ORS-keratinocytterne normalt fjernes ved plukning, kommenterer forfatterne, at de derfor ikke repræsenterer stamceller, men snarere celler, der er vigtige for hårvækst i løbet af en enkelt cyklus . Celler med lang levetid var lokaliseret i centrale dele af den ydre rodkappe tæt på udbulningsområdet, hvorimod celler med lang levetid også inkluderet i plukkede hårsække kunne være et øjeblikkeligt afkom af stamceller, der ville være adskilt i udbulningsområdet .Gho og kolleger undersøgte og bekræftede tilstedeværelsen af stamceller i plukkede anagen hårsække fra hovedbunden occipital område . Dette blev opnået ved test for cytokeratin 19, en markør hævdet af Michel et al. at være positiv for stamceller; de lokaliserede indirekte disse celler . Det blev også hævdet, at da stamceller krævede beskyttelse mod apoptotisk hårcyklus, ville undersøgelse af apoptoseundertrykkende Bcl-2-protein sammen med fraværet af den apoptosefremmende Baks være en anden pålidelig metode, hvormed efterforskerne kunne se efter tilstedeværelsen af stamceller .
en anden pålidelig metode til at identificere keratinocytstamceller gør brug af det faktum, at disse celler normalt er langsomme, og derfor kan identificeres eksperimentelt som de “etiketholdende celler” (LRC ‘ er) . I denne tilgang mærker man alle cellerne i epitelet ved en gentagen eller kontinuerlig tilførsel af tritieret thymidin efterfulgt af en lang jagtperiode, hvor etiketten går tabt fra Al cykling, transitforstærkende (TA) celler, hvilket kun tillader celler, der cykler langsomt (stamcellerne) for at bevare etiketten . Langsomtcyklerende celler i hårsækken blev fundet af Taylor og kolleger udelukkende begrænset til et tidligere ignoreret område kaldet bule, med den del af den ydre rodkappe, der markerer det laveste punkt i den øvre, permanente del af folliklen, såvel som fastgørelsesstedet for arrector pili-muskelen.
Yamauchi og Kurosaka undersøgte tilstedeværelsen af stamceller i udbulningsområdet af plukkede hårsække fra hovedbunden . Efterforskerne fokuserede på tilstedeværelsen af glycogensyntasekinase-3 (GSK-3), et protein, der, når det hæmmes, øger niveauerne af LARP-catenin, der er direkte involveret i hårsækkets morfogenese og stamcelledifferentiering . Tilstedeværelsen af GSK – 3 i denne region blev bekræftet ved at lede efter dets genetiske ekspression ved RT-kpcr og ved vestlig blotting med et GSK-3 beta-specifikt antistof, Y174 . Sasahara et al. detekterede stamceller i udbulningsområdet gennem tilstedeværelsen af CD34-ekspression, som er en stamcellebiomarkør sammen med andre stamcellebiomarkørgener såsom CD200, Soks2 og NANOG . Morfologi og ekspression af keratinfamiliegener i bulkafledte follikler (BDK ‘ er) før og efter differentieringsinduktion med calciumchlorid svarede til dem af epidermale keratinocytter opnået fra hudbiopsier (NHEKs) . De viste også, at BDK ‘ er var mere ildfaste over for differentiering end epidermale keratinocytter opnået fra hudbiopsier .
3.1. Humane Follikelafledte keratinocytter
Yoshikava et al. undersøgt opregulering af gener, der er involveret i keratinocytdifferentiering, specifikt det nye markørgen ID2 . De opnåede dette ved at bruge kontaktfølsomme midler i dyrkede keratinocytter afledt af udbukken af plukkede hårfollikler, også kendt som bulge-afledte keratinocytter (BDK ‘ er) . Deres teknik var en effektiv og enkel metode til at etablere stammer af humane BDK ‘ er uden brug af invasive hudbiopsier . BDKs viste primære reaktioner på sensibilisatorer ledsaget af opregulering af generne, der orkestrerer keratinocytdifferentiering, inklusive ID2-genet og den NRF2-medierede signalvej . Bdk ‘ er blev individuelt etableret uden invasive biopsier og blev muligvis et kraftfuldt værktøj til evaluering af donor-til-donor-variationer over for sensibilisatorerne .
3.2. Omprogrammering af stamceller fra plukket håraksel
omprogrammering af somatiske celler til inducerede pluripotente stamceller (IPS) kan opnås gennem tvungen ekspression af specifikke transkriptionsfaktorer, især kombinationen af Oct4, Soks2, Klf4 og c-Myc (OSKM) . Disse programmerede celler ligner embryonale stamceller og er kendetegnet ved det ubegrænsede potentiale for selvfornyelse og evnen til at differentiere sig til enhver celletype . Teknikken til generering af iPS-celler har revolutioneret feltet, der undersøger de molekylære mekanismer for cellulær pluripotens og letter dannelsen af patientspecifikke celler til celleudskiftningsterapi . Etiske og værtsafvisningsproblemer, der ofte er forbundet med ES-celleteknologi, er blevet reduceret, skaber stor interesse og løfte om fremtidige kliniske applikationer . Omprogrammering er langsom og ineffektiv, og det fulde omfang af, om IPS-celler kan erstatte ES-celler i alle aspekter, diskuteres stadig, og delvis omprogrammering eller “over-omprogrammering” udgør udfordringer .
Keratinocytafledte iPS-celler (KiPS) kan etableres ud fra små mængder biologisk prøve inklusive plukkede hår. Et stort antal keratinocytter er blevet dyrket med succes fra plukket hår . Et enkelt hår plukket fra en 30-årig kvinde er blevet brugt af Aasen et al. at generere keratinocyt inducerede pluripotente stamceller . En eksperimentel model til undersøgelse af baserne for cellulær omprogrammering og potentielle fordele ved at bruge keratinocytter til at generere patientspecifikke iPS-celler er beskrevet . Aasen og Belmonte beskriver en metode, der bruger plukket hår ORS keratinocytter og angiver, at direkte plukning af hår hovedsageligt isolerer transitforstærkende celler med kortvarigt kulturpotentiale .
stamceller afledt af plukkede hårsække er med succes blevet omprogrammeret til to meget vigtige og relativt utilgængelige væv, neurale celler og hjerteceller . Omprogrammering blev opnået ved anvendelse af en enkelt polycistronisk punktafgiftspligtig lentiviral vektor . Novak et al. viste, at alle kolonierne var sande iPSC ‘ er, havde typiske egenskaber ved humane embryonale stamceller og differentierede sig i alle de tre kimlag både in vitro og in vivo . Følgelig blev funktionelle hjertemyocytter med succes afledt og karakteriseret fra humane hårfollikel keratinocytter HFKT-iPSC ‘ er og udviste velkoordinerede intracellulære Ca2+ transienter og sammentrækninger .
i en anden undersøgelse foretaget af Petit og kolleger viste keratinocytter, der blev isoleret fra hårsækkene, at være en ideel kilde til patienters celler til omprogrammering . De brugte kun et lille antal plukkede menneskelige hårsække fra to raske donorer for at omprogrammere keratinocytter til pluripotente stamceller . Gruppen formåede også yderligere at differentiere disse programmerede stamceller til neurale stamceller, herunder forebrain neuroner og funktionelle dopaminerge neuroner .
gennemgangspapiret af Muller et al. nævner modellering af menneskelige kanalopatier plukkede hårsække som en let tilgængelig kilde til iPSC ‘ er. Genererede iPSC ‘ er betragtes som et nyttigt værktøj til at belyse patofysiologiske mekanismer i forskellige sygdomstilstande, blandt hvilke nævnes diabetes, blodsygdomme, definerede neurologiske lidelser og genetisk leversygdom . Linta et al. brugte humane keratinocytafledte inducerede pluripotente stamceller (hipsc ‘ er) til at se på mRNA-ekspressionsniveauer af ionkanalgener mellem sådanne celler og deres somatiske cellekilde, keratinocytter fra plukket menneskehår .
4. Genekspressionsprofilering
Genekspressionsprofilering (GEP) er en vigtig forskningsvej for at forstå, hvordan celler og væv fungerer under normale forhold, karakterisere svarene på toksikologiske eller farmaceutiske eksponeringer og belyse molekylære mekanismer forbundet med aldring, sygdomsudvikling og progression. Flere forfattere har brugt RT til at analysere ekspressionen af et begrænset antal gener i voksne plukkede menneskelige hårsække . Kim et al. fremhæv det faktum, at RNA af tilstrækkelig mængde og kvalitet til anvendelse i mikroarray-hybridiseringer kunne opnås fra en enkelt plukket menneskehårfollikel . Det gennemsnitlige kvantificerbare udbytte af RNA / follikel var 112,5 ng . Ribosomale forhold var lavere end normalt forventet, men undersøgelse viste, at RNA var intakt . De fulde optegnelser over gener udtrykt i hårsækkene hos hver af de 10 forsøgspersoner, der blev undersøgt i deres undersøgelse, blev deponeret med genekspression omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) .
Ohyama et al. viste, at human bulge cellebiologi kunne lettes ved analyse af globale genekspressionsprofiler og identifikation af unikke celleoverflademarkører . Undersøgelser af buleceller er blevet hæmmet af manglen på karakteristisk bulemorfologi i menneskelige hårsække . Ved hjælp af navigeret laserfangst mikrodissektion bestemte forfatterne fordelingen af etiketholdende celler for at definere den menneskelige anagenbukke . Gener, der er ansvarlige for celleproliferation, var underrepræsenteret, i overensstemmelse med eksistensen af hvilende ikke-cyklende KSC ‘ er i anagenfollikler .
sammenlignende genekspressionsprofilering er blevet brugt til at skelne atopisk eksem fra nonatopisk eksem . Humane hårfollikelafledte keratinocytter (FDK ‘ er) blev dyrket af plukkede hår taget fra de to grupper . Mikroarray-analyse og kvantitativ RT-PCR blev brugt til at generere genekspressionssignaturer, der kan skelne atopisk dermatitis fra ikke-atopiske kontroller uden hudbiopsier . Patientafledte FDK ‘ er, individuelt etableret uden invasive biopsier, kan være en ideel cellekilde til undersøgelse af hudsygdomme in vitro .
5. Diagnostiske og kliniske anvendelser af plukket hår
plukkede håraksler bliver et nyttigt diagnostisk værktøj under dermatologiske forhold. Direkte immunofluorescens (DIF) af perilesional hud er guldstandarden i diagnosen pemphigus . Rao et al. har brugt ORS af plukkede anagenhårskakter til at detektere pemphigus-specifikt immunofluorescensmønster og konkluderede, at DIF af plukket hår er en enkel, ikke-invasiv test, der i fremtiden kan lindre behovet for hudbiopsier hos patienter med pemphigus .
5. 1. Autolog Epidermal ækvivalent
keratinocytter af den ydre rodkappe af plukkede anagenhårfollikler blev anvendt af Tausche et al. at generere fuldt differentierede autologe epidermale ækvivalenter . De rapporterer resultater fra en multicenter, randomiseret fase II-undersøgelse for Epideks, et varemærke for en vævskonstrueret, fuldt differentieret autolog epidermal ækvivalent, der var lige så effektiv som autografting af hud med delt tykkelse til fremme af heling og fuldstændig lukning af genstridige vaskulære bensår . Limat et al. brugte autologe in vitro rekonstruerede epidermale ækvivalenter og viste, at efter 2 måneder kunne en tredjedel af tilbagevendende bensår heles . Brugen af autologe keratinocytter isoleret fra plukkede humane hårsække i hovedbunden viste sig at give en række fordele, herunder den lette, ikke-invasive isolering af ORS-keratinocytter fra plukkede anagenhårfollikler og deres evne til at opretholde en høj proliferativ kapacitet i kultur, selv når de stammer fra meget gamle donorer .
5. 2. Tredimensionelle Hudækvivalenter
tredimensionelle hudækvivalenter (SE) er blevet anvendt i farmakologisk og toksikologisk forskning til erstatning for dyreforsøg og cellemonokulturer . Desuden er de vellykkede værktøjer til podning af kroniske sår eller brændt hud og i transplantationsmedicin. Hoeller et al. udviklet en forbedret og hurtig metode til at konstruere autologe SEs fra humane plukkede hårsække og fibroblaster . Ved at bruge anagenfase plukkede håraksler, der blev valgt ved lysmikroskopi og implanteret dem i dermale ækvivalenter, processen med at generere autolog SE blev forkortet fra 30 til 20 dage .
5, 3. Surrogatvæv i farmakokinetiske/Farmakodynamiske studier
plukkede hårsække har tilsluttet sig listen over surrogatvæv til kræftforskning sammen med perifere mononukleære blodceller (Pbmc ‘ er), blodpladerigt plasma, hudbiopsier og orale bukkalbytter. Vævsbaserede tilgange til undersøgelse af farmakodynamiske endepunkter i tidlige fase onkologiske kliniske forsøg er blevet udvidet siden udviklingen af målrettede lægemiddelterapier, hvor den optimale biologiske dosis foretrækkes frem for den maksimalt tolererede dosis. Definitionen af optimal dosis kan fastlægges ud fra farmakokinetiske endepunkter eller fortrinsvis ved at demonstrere den ønskede virkning på målmolekylet.
forfatterne Camidge et al. har beskrevet brugen af plukkede hårsække og muligheden for at detektere og kvantificere cellecyklus og DNA-reparationsrelaterede faktorer, såsom Ki67, pRb, p27 og phosphoryleret p27, pRb og histon . Effekten af antitumorinhibitorer af phosphatidylinositol-3-kinase (PI-3-K)/Akt (proteinkinase B) signalering hos kræftpatienter er blevet målt af Vilhelm et al. . Plukkede hårsække i hovedbunden blev brugt som surrogat normalt væv til at måle virkningerne af inhibitorer af PtdIns-3-kinase og Akt på PtdIns-3-kinase signalering . Undersøgelsen viste, at phosphoSer473-Akt-farvning i keratinocytterne i den ydre kappe af hår blev hæmmet af en PtdIns-3-kinasehæmmer i dyrket menneskehår . Resultaterne af undersøgelsen antyder, at individuelle menneskehår kunne tilvejebringe en minimalt invasiv måde at måle virkningerne af PtdIns-3-kinase-signalinhibitorer hos patienter, der afspejler inhibering af tumorphospho-Akt . plukkede håraksler ekstraheret fra øjenbrynene såvel som mononukleære celler i perifert blod er blevet brugt af Fong et al. som surrogatvæv for at teste hypotesen om, at patienter med tumorer forbundet med BRCA1-eller BRCA2-mutationer ville vise et objektivt antitumorrespons på olaparib, en ny og potent, oralt aktiv Poly(adenosindiphosphat-ribose) polymerase (PARP) hæmmer . I et klinisk fase 1-forsøg blev sikkerheden, bivirkningsprofilen, den dosisbegrænsende toksicitet, den maksimalt tolererede dosis, den dosis, hvor PARP maksimalt hæmmes, og dets farmakokinetiske og farmakodynamiske profiler undersøgt . Plukkede øjenbryn hårfollikler sammen med perifere blodmononukleære celler blev brugt til at bekræfte PARP-hæmning i disse surrogatprøver . Tilsvarende, Ang et al. gennemgået begrundelsen, fordele og ulemper, og de praktiske overvejelser af vævsbaserede tilgange til at udføre farmakodynamiske undersøgelser i tidlige fase onkologiske kliniske forsøg ved hjælp af casehistorier af molekylære målretningsmidler såsom PI3K, m-TOR, HSP90, HDAC, og PARP-hæmmere .
6. Perspektiver
den plukkede hårskaft er blevet brugt i medicinsk forskning i de sidste 60 år. Dette” mini ” organ bliver en vigtig testplads inden for biomedicinsk forskning. En mest spændende rolle for plukkede håraksler udvikler sig inden for stamcelleprogrammering og udvikling af autologe epidermale ækvivalenter. Brugen af plukket hårskaft som surrogatvæv i fase 1 forsøg til kemoterapeutisk lægemiddeludvikling såvel som dets anvendelse som en surrogatvævsmodel i systembiologiske tilgange til medicinsk forskning vil blive vigtigere i den nærmeste fremtid.
anerkendelse
forfatterne vil gerne takke hr. Anton Abela (Institut for Klinisk Farmakologi og terapi, Fakultet for medicin og Kirurgi, University of Malta) til design af figuren præsenteret i dette papir.