PMC

under translokationstrinnet i forlængelsesfasen af proteinsyntese fremføres mRNA ‘et Med et kodon, koblet til bevægelse af tRNA’ erne fra ribosomal a (aminoacyl) til P (peptidyl) og P til E (udgangssteder) i en proces katalyseret af forlængelsesfaktor EF-G (1). For det første bevæger tRNA ‘erne sig på 50S-underenheden til P/E-og A/P-hybridtilstande efterfulgt af bevægelse af tRNA-anticodonstamsløjferne (ASL’ er) fra 30S-underenheden A-og P-lokaliteterne til henholdsvis P-og E-lokaliteterne koblet til bevægelse af deres tilknyttede mRNA-kodoner (2). Det første trin ledsages af intersubunitrotation (3-7), mens det andet trin kræver EF-G·GTP og involverer rotation af 30s underenheds hoveddomæne (8-11). Selvom der for nylig er lært meget om det strukturelle grundlag for P-tRNA-bevægelse til E-stedet (9, 10, 12, 13), translokationsmellemprodukter indeholdende a-tRNA er sværere at fange. Således har meget af vores tænkning om det strukturelle grundlag for a-tRNA og mRNA-bevægelse været baseret på krystalstrukturer af EF-G bundet til ledige (14) eller P-tRNA-holdige ribosomkomplekser fanget i klassiske (15) eller hybridtilstande (10, 12, 13) og to cryo-EM-strukturer af 70s ribosome-EF-G-komplekser indeholdende to tRNA ‘ er bundet i P / E og A / P* hybridtilstande (16) eller i ap/P og pe/e kimære hybridtilstande (11).

Her rapporterer vi krystalstrukturen af et 70s ribosomtranslokation mellemprodukt indeholdende EF-G, mRNA og to tRNA ‘ er – en deacyleret tRNA bundet i pe/E-tilstand og en peptidyl-tRNA fanget i en ap / ap kimær hybrid tilstand. Komplekset blev dannet med T. thermophilus 70s ribosomer, et 39-nukleotid mRNA, elongator tRNAMet på P-stedet og N-acetyl-Val-tRNAVal på a-stedet. For at fange translokationsmellemproduktet tilføjede vi neomycin for at blokere færdiggørelse af translokation og fusidinsyre for at forhindre frigivelse af EF-G (supplerende metoder; Fig. S1). Strukturen blev løst ved hjælp af diffraktionsdata til 3,8 liter opnået fra en enkelt krystal (tabel S1). Eksempler på elektrondensitet er vist i supplerende materialer (Fig. S2-S13). I forhold til klassisk-tilstandsribosomet (17) gennemgår 30s underenheds hoved en stor 21 liter mod uret rotation, og 30s krop en 2,7 liter rotation i forhold til 50S underenhed (Fig. 1, Fig 2A, B). P-tRNA anticodon stamsløjfe (ASL) bevæger sig med 30 ‘ernes hoved i en position mellem p-stedet for 30’ ernes hoved og e-stedet for 30 ‘ ernes krop (pe kimær tilstand; Fig 1D, E), mens dens acceptorende bevæger sig helt ind i 50s E-stedet (Fig 1C) og danner en PE/E kimær hybridtilstand (9-11). A-tRNA ASL bevæger sig inden for ~4 liter af P – site-elementerne i 30s-legemet (Fig. 1D); dens albue roterer mod det klassiske 50s P-sted, men dens acceptorende er bundet mellem 50S underenhed A og P-steder (Fig. 1C), der danner en ap / ap kimær hybrid tilstand. Den store, EF-g-afhængige rotation af 30s-hovedet i vores struktur repositionerer spiral H38 af 23S rRNA, hvilket gør det muligt for a-tRNA-albuen at nå positionen af P-site tRNA-albuen (Fig. S14). Domæne IV af EF-G er klemt ind i stedet for konvergens af a-site mRNA codon, anticodon loop af ap/ap tRNA, og 16S og 23S rRNA ‘er ved intersubunit bridge B2a, samtidig kontakt med alle fire RNA’ er (Fig. S15).

selvom 30s hovedrotation klart letter P-site ASL-translokation (9-11), a-site ASL translokeres af en anden mekanisme. P-site ASL bevæger sig præcist med 30s hovedrotation i pe/E-tilstand, hvorimod a-site ASL har bevæget sig længere end hovedets rotationsbevægelse ind i ap-tilstand på 30S-underenheden (Fig. 1E). Bevægelse af A-site ASL præcist med hovedrotation ville resultere i alvorlig sammenstød med domæne IV af EF-G, da det er placeret i vores kompleks, som sammen med kontakten dannet mellem spidsen af domæne IV og codon-anticodon spiralen af ap/ap tRNA (Fig S16) antyder, at bevægelse af mRNA og ASL er koblet til domæne IV. den yderligere forskydning af ap/ap ASL bringer den tæt på pe/E ASL (Fig. 2C, D) (11). Hovedets position kan stabiliseres ved interaktion mellem phosphat 1210 af 16S rRNA med domæne IV af EF-G ved Gly531.

mest slående er omlægningen af 16S rRNA 966-sløjfen i 30s-hovedet, der bryder væk fra P-stedet for at nå mod a-stedet, hvor det indleder kontakt med den delvist translokerede ap / ap-ASL (Fig. 2E, F). Denne omlægning involverer afbrydelse af pakningen af m22G966 mod ribose 34 på P-site ASL (18, 19) og dannelse af en overfladetilpasningslomme omkring ap/ap-ASL ved nukleotider a965, m22G966 og C1400. I en krystalstruktur af det tilsvarende enkelt-tRNA-kompleks (10) (Fig. S6), pe/E tRNA ASL viste sig at opretholde alle kanoniske P-site-kontakter med 30s-hovedet, inklusive 966-sløjfen, når den roterer mod E-stedet. I det to-tRNA-kompleks, der er rapporteret her, opretholdes imidlertid kun et undersæt af P-site 30s hovedinteraktioner med pe/E ASL, der involverer G1338, a1339, a1340 og den C-terminale hale af protein uS9. Dannelsen af interaktioner efter translokation samtidig med forstyrrelse af interaktioner før translokation antyder en mekanisme til, hvordan ASL ‘ erne afleveres mellem A-og P-stederne. Det kan også repræsentere et indledende skift i Kontakter, der skal forstyrres for at frigive pe/E tRNA ASL før back-rotation af 30s-hovedet i de sidste faser af translokation (20, 21).

netværket af interaktioner dannet mellem den konserverede sløjfe 1 (rester 499-504) i domæne IV af EF-G, ap/ap ASL og dets mRNA-kodon (Fig. S15) (11) svarer til dem, der observeres i post-translokationstilstand (15), hvilket antyder, at de opretholdes gennem hele translokationscyklussen. Deres lighed med mindre-groove interaktioner foretaget af a1492 og A1493 med codon-anticodon spiralen i afkodningsstedet (22) antyder, at de kan bidrage til at opretholde korrekt codon-anticodon parring under bevægelse mellem A og P steder (15), og er i overensstemmelse med forslaget om, at EF-G Letter translokation ved destabiliserende interaktioner i 30s afkodning site (23).

interaktioner mellem mRNA og elementer i 30s-hovedet inden for den nedstrøms mRNA-indgangstunnel er blevet foreslået at føre mRNA fremad med tRNA under hovedrotation (17). Det er imidlertid ikke klart, at netbevægelsen af mRNA ‘ et kunne opretholdes på denne måde, fordi disse interaktioner forstyrres under hovedrotation. Vi finder ud af, at den forlængede hale af mRNA ‘ et, som det fremgår af nedstrøms tunnelen, kurver opad for at binde til overfladen af protein uS3 i underenhedens hoved (Fig. 3, S17). Således vil fremadgående hovedrotation aktivt bevæge mRNA ‘ et i retning af translokation. Sammenligning af positionen af et referencenukleotid på mRNA ‘et i de roterede og ikke-roterede tilstande viser yderligere, at fremadrettet hovedrotation ville fremme mRNA’ et Med et kodon (Fig. 3D), der understøtter muligheden for, at mRNA ‘ et bevæges aktivt af ribosomet under translokation. Da dimensionerne af nedstrøms tunnelen udelukker indtræden af en RNA-spiral, skal forstyrrelse af mRNA sekundær struktur af ribosomal helicase (24) forekomme ved eller nær indgangen til tunnelen ved interaktion med ribosomet uden for tunnelen. Binding af mRNA-halen, der straks flankerer indgangen til tunnelen udelukkende til 30 ‘ ernes hoved, giver en sådan interaktion. Kræfterne skabt af hovedrotation kunne således destabilisere baseparring i spiralformede elementer af mRNA, når de kommer ind i nedstrøms tunnelen.

i den klassiske tilstand danner C74 og C75 i CCA-halen af P-site tRNA basepar med henholdsvis g2252 og G2251 i P-sløjfen (H80) på 23S rRNA, mens C75 af a-site tRNA parrer med G2553 i A-sløjfen (H92) (18, 25, 26). Disse interaktioner placerer peptidyl-og aminoacyldelene for peptidyltransferasereaktionen (27), som efterlader et deacyleret tRNA på P-stedet og et peptidyltrna på a-stedet. Et kritisk trin i translokation er derfor den efterfølgende bevægelse af peptidyl-CCA-enden fra A-sløjfen til P-sløjfen. Strukturen af translokationsmellemproduktet afslører en kimærisk tilstand, der adskiller sig fra de tidligere beskrevne (Fig. S18), hvor acceptorenden af peptidyl-tRNA interagerer samtidigt med både A-og P-sløjferne (Fig 4). I denne tilstand bevares basisparring af C75 med G2553 af A-sløjfen, mens bevægelse af dens acceptorstamme til en position nær den for klassisk p-site tRNA tillader G2252 og G2253 i en omarrangeret P-sløjfe at komme i kontakt med tRNA-rygraden i position 72 og 70 (Fig. 4B). Således er enden af acceptorstammen af ap/ap-tRNA forankret på P-sløjfen, hvilket letter overførsel af dets tilstødende C74-og C75-rester fra A-sløjfen til P-sløjfen. A76 af ap / ap tRNA er orienteret på samme måde som observeret for tRNA bundet i p/p klassisk tilstand (17) med sin N-acetyl-valin peptidyldel placeret ved indgangen til peptidudgangstunnelen, hvorimod C74 og C75 opretholder deres interaktioner med A-sløjfen på 23S rRNA (Fig. 4, S19).

acceptorenden af ap/ap tRNA kontakter samtidig A-og P-sløjferne på 23S rRNA

under translokation bevæger 3′ acceptorenden af peptidyl-tRNA sig fra (A) klassisk a/a-tilstand til (B) mellemliggende ap/ap-tilstand til (C) klassiske P / P-tilstande, lettet af konformationsændringer i A-og P-sløjferne.

ap / ap-tRNA kan svare til mellemliggende tilstande, der er blevet karakteriseret kinetisk. Fluorescensslukende kinetiske undersøgelser identificerede et EF-G-afhængigt mellemprodukt (INT), hvor peptidyl-tRNA-albuen bevæger sig fra A-stedet mod P-stedet, men forbliver kun delvist reaktiv med aminoacyl-tRNA-efterligningen puromycin, hvilket antyder, at dens CCA-ende ikke er fuldt optaget på P-stedet (28). Kinetiske undersøgelser, hvor en sonde blev bundet direkte til peptidyl-tRNA CCA-enden, identificerede EF-G-afhængige translokationsmellemprodukter, hvor acceptorenden af peptidyl-tRNA bevæger sig mod P-stedet, men forbliver puromycin-ureaktiv (29). Egenskaberne af disse mellemprodukter er kompatible med den fangede ap/ap-tilstand, der observeres her. Strukturen af dette fangede translokationsmellemprodukt begynder at beskrive, hvordan tRNA bevæger sig mellem ribosomale A-og P-steder. TRNA-bindingsstederne selv er dynamiske og danner samtidige kontakter mellem A-tRNA og elementer af både A-og P-lokaliteterne, der ligner stafetten i et stafetløb (30). Dette ses for både 30 ‘erne og 50′ erne underenheder. I 30S-underenheden frigiver omlægning af 966-sløjfen på 16S rRNA G966 fra P-site ASL for at kontakte a-site ASL, når den bevæger sig ind i 30s P-stedet (Fig. 2E, F). I 50S-underenheden omarrangeres A-og P-sløjferne på 23S rRNA for at give begge sløjfer mulighed for at kontakte 3’ – acceptorenden af a-site tRNA, når den begynder sin overgang til 50S P-stedet (Fig. 4). Disse fund viser, at den strukturelle dynamik af ribosomalt RNA spiller en aktiv rolle i translokationsmekanismen.