Robert De Niro Sr. blev født i Syracuse, NY York, til en irsk-amerikansk mor, Helen M. (N kurte O ‘ Reilly; 1899-1999). Helens mor var Mary E. Burns (født af John og Mary Burns) og hendes far var Dennis Francis O ‘Reilly, født til Dundrum’ s Ellen Hall, Edvard O ‘ Reillys anden kone. Der var tidligere forvirring om Dennis ‘ moderskab, hans mor troede tidligere at være Edvards anden kone Margaret.Roberts italiensk-amerikanske far, Henry Martin De Niro (1897-1976), blev født af forældre, der emigrerede fra Ferrasano i 1887, Angelina Mercurio og Giovanni di Niro.Robert var den ældste af tre børn; han og søskende John og Joan blev opvokset i Syracuse. De Niro studerede på det berømte Black Mountain College under Josef Albers fra 1939 til 1940. Mens Albers ‘ meget analytiske tilgang til maleri ikke appellerede til De Niros mere instinktive stil, efterlod Bauhaus-mesterens oplevelse og internationale perspektiv ikke desto mindre et varigt indtryk. De Niro studerede hos Hans Hofmann på sin sommerskole i Massachusetts. Hofmanns undervisning om abstrakt ekspressionisme og kubistisk formalisme havde en stærk indflydelse på De Niros udvikling som moden kunstner.
på Hofmanns sommerskole mødte han medstuderende Virginia Admiral, som han giftede sig med i 1942. Parret flyttede ind i en stor, luftig hems i landsbyen, hvor de kunne male. De omringede sig med en berømt vennekreds, herunder forfattere Ana Kris Nin og Henry Miller, dramatiker Tennessee Vilhelmog skuespillerinden og den berømte Berlin-danser Valeska Gert. Admiral og De Niro skiltes kort efter, at deres søn Robert De Niro Jr.blev født i August 1943, efter at De Niro kom ud som homoseksuel. I 1944 havde De Niro et forhold til digteren Robert Duncan.efter at have studeret hos Hans Hofmann og Josef Albers på Black Mountain College, North Carolina i slutningen af 1930 ‘erne og begyndelsen af 1940’ erne arbejdede De Niro i fem år på Hilla Rebays legendariske Museum for ikke-objektiv kunst. I 1945 blev han med i en gruppeudstilling på Peggy Guggenheims kunst af dette århundrede i Ny York, som var et førende galleri for kunsten for både etablerede europæiske modernister og medlemmer af den nye abstrakte ekspressionistiske gruppe som Jackson Pollock, Mark Rothko, Robert og Clyfford Still. De Niro havde sin første soloudstilling på Guggenheims galleri i April og Maj det følgende år. På det tidspunkt arbejdede han primært på en abstrakt måde, ofte med figurreferencer. Meget af hans arbejde fra denne periode gik tabt i en studiebrand i 1949.
De Niro havde en række soloudstillinger i 1950 ‘ erne på Charles Egan Gallery i Ny York, der udstillede værket af Villem de Kooning og andre tidlige abstrakte ekspressionistiske kunstnere. Kritikere roste deniros kompositioner fyldt med improviserede områder med levende farve, der gav plads til løst malede stilleben og kurvede nøgenbilleder. I midten af 1950 ‘ erne blev De Niro regelmæssigt inkluderet i vigtige gruppeudstillinger som f.eks. Han blev tildelt en Longse Foundation-pris i 1958.
fra 1961 til 1964 rejste De Niro til Frankrig for at male i Paris og i det omkringliggende landskab. Collector Joseph Hirshhorn købte en række af kunstnerens malerier og værker på papir i denne periode gennem De Niros gallerist, Virginia, som nu er i den permanente samling af Hirshhorn Museum and Sculpture Garden. I 1968 blev han tildelt et Guggenheim-stipendium.