der er ofte meget forvirring over betydningen af ‘enheder’, ‘aktivitet’ og ‘specifik aktivitet’. Denne vejledning forklarer disse nøglebegreber i enkle vendinger og diskuterer analysedesign og vigtigheden af at operere i det ‘lineære område’. Vi overvejer også standardkurver, og om du skal plotte koncentration eller absolut mængde produkt på h-aksen. Nogle tip til opsætning af analysekontroller og subtraktion af emner diskuteres. Endelig forklarer vi, hvordan aktivitetsværdier beregnes, og vi giver et simpelt overblik over kinetiske ligninger.
definitioner af enheder
ville være mindre kompliceret, hvis alle brugte den samme enhedsdefinition. 1 enhed (U) er den mængde, der katalyserer reaktionen af 1 umol substrat pr.minut (definition a).
i de fleste R&d-indstillinger er 1 umol substrat faktisk ret meget materiale, og andre definitioner kan foretrækkes for at undgå at udtrykke mængder i fraktioner af enheder. 1 enhed (U) er den mængde, der katalyserer reaktionen af 1 nmol substrat pr.minut (definition B).
Bemærk, at ændringen i definition har en dybtgående indvirkning på det angivne antal enheder, dvs. 1 enhed i henhold til definition a ville svare til 1000 enheder i henhold til definition B!
Du kan også se enheder udtrykt som milli-enhed (eller mU), som simpelthen betyder en tusindedel af en enhed, uanset hvordan enheden er defineret.det er klart, at den faktiske mængde i et rør ikke ændres ved blot at ændre enhedsdefinitionen, men det er nødvendigt med omhu, når man sammenligner aktiviteterne i prøver fra forskellige leverandører. Så længe enhedsdefinitionerne er angivet, kan du omdanne det angivne antal enheder til nmol pr.
for klarhed i dit eget arbejde foretrækker du måske at bruge ‘nmol per min’ (eller ‘umol per min’), men hvis konstant gentagelse er påkrævet, har det meget kortere udtryk ‘enhed’ sine attraktioner.
Hvad er aktivitet
aktivitet er angivet i enheder pr.ml (U / ml), med andre ord nmol pr. min pr. ml (hvis enhedsdefinition B er vedtaget). Aktivitetsværdier udtrykt i enheder er således også underlagt en illusorisk 1000 gange ‘stigning’, hvis man skifter fra enhedsdefinition A til enhedsdefinition B. Igen kan der ikke være nogen forvirring, hvis aktiviteten udtrykkes i form af nmol pr.da aktiviteten vedrører koncentration, kan to hætteglas indeholde det samme antal enheder (i alt), men har forskellige aktiviteter (koncentrationer).
Hvad er specifik aktivitet?
specifik aktivitet er antallet af enheder pr.ml divideret med koncentrationen af protein i mg/ml. Specifikke aktivitetsværdier citeres derfor som enheder / mg eller nmol/min/mg (hvis enhedsdefinition B anvendes).
specifik aktivitet er et vigtigt mål for renhed, og værdier for forskellige batcher af et rent indhold skal være de samme inden for normal eksperimentel fejl.
serielle fortyndinger af en opløsning vil have forskellige aktivitetsværdier, men identiske specifikke aktivitetsværdier, fordi tælleren (enheder/ml) og nævneren (mg / ml) ved beregning af specifik aktivitet påvirkes ligeligt af prøvefortynding.selvom specifik aktivitet er meget forskellig fra aktivitet, er beregningen af specifik aktivitet ikke desto mindre afhængig af aktivitetsværdien, og derfor vil den angivne specifikke aktivitetsværdi også være afhængig af definitionen af enhed. Batcher, der er under den forventede specifikke aktivitetsværdi, kan indeholde urenheder eller molekyler, der er blevet denatureret.
faktorer, der påvirker aktivitet
i dette afsnit diskuterer vi, hvorfor en aktivitet kan have forskellige målte aktivitetsværdier i forskellige laboratorier. Med dette mener vi reelle forskelle i målt aktivitet, ikke tilsyneladende forskelle forårsaget af brugen af forskellige enhedsdefinitioner.
de betingelser, hvorunder en analyse udføres, vil påvirke de rapporterede aktivitetsværdier. For eksempel udføres assays typisk ved en temperatur mellem 20-37 liter C. Generelt vil en dosis være mere aktiv ved 37 liter C end ved 20 liter C.
definitionen af enheden ville være bedre udtrykt således:
1 enhed (U) er mængden, hvis den katalyserer reaktionen af 1 nmol substrat pr.minut under standardbetingelser.
desværre er udtrykket ‘standardbetingelser’ åbent for fortolkning, og der kan være forskellige brugerpræferencer, i det mindste i R&d miljøer. Således kan ti forskellige forskningslaboratorier (helt korrekt) beregne forskellige aktiviteter for den samme opløsning. De fleste forskningslaboratorier etablerer deres egne ‘standardbetingelser’ og kontrollerer hver ny batch internt. I kliniske omgivelser defineres ‘standardbetingelser’ eksplicit, og alle laboratorier skal køre identiske analyser.
udvikling af analyser og betydningen af lineært interval
aktivitetsværdien (enheder / ml) for din analyse er den vigtigste parameter, når du udvikler en analyse. Dette skyldes, at volumen (dvs.antal enheder), du tilføjer, bestemmer mængden af substrat, der konverteres til produkt. Husk, at 1 enhed katalyserer omdannelsen af 1 nmol substrat pr.
de rapporterede enheder / ml kan give dig en grov ide om, hvor meget der skal tilsættes, men da aktivitetsværdien muligvis ikke er bestemt i en test, der er identisk med din, er det normalt at forberede serielle fortyndinger af stoffet (f.eks. logfortyndinger oprindeligt) og at teste et fast volumen af hver fortynding. Afhængigt af analysesignalet (som vil være relateret til mængden af konverteret substrat) kan der kræves et andet eksperiment for at komme ind på en passende fortynding.
Hvad er den ‘bedste’ fortynding? For at besvare dette, er vi nødt til at tænke over det vigtigste aspekt af assay design – linear range. Det er vigtigt for kvantitativt arbejde at operere i et område, hvor et plot af analysesignal (ofte absorbans) versus f.eks. De fleste analyser er lineære, hvis graden af substratkonvertering er mindre end 15%, forudsat at der ikke er andre begrænsende faktorer. 30 min) og temperatur (f.eks. 25oC) kan konverteringsgraden styres ved blot at justere en parameter, dvs. antallet af tilføjede enheder.
dette illustreres grafisk i Figur 1 med fortyndinger udtrykt som reciprocals (dvs.fortynding på 1/10 = 0,1 på h-aksen). Dit eget plot kan variere i form og lineært område, men ved meget høj koncentration vil analysesignalet uden tvivl ikke stige i forhold til mængden af tilsat.analysen i Figur 1 er lineær op til optisk densitet (OD) 2.5 og en fortyndingsfaktor på 0.02 (1/50 fortynding) ville være ideel til analysearbejde, da det giver et stort signal (~1.5) og ligger midt i det lineære område. Beregninger baseret på resultater for fortyndingsfaktorer i området mellem 0,04 og 0,12 (dvs.regionen med reduceret hældning) vil undervurdere det sande niveau af f. eks.
mange faktorer kan fungere for at begrænse det lineære interval, og området vil variere fra assay til assay. En almindelig årsag til ikke-linearitet er overdreven forbrug af substrat, hvilket kan få reaktionshastigheden til at falde, men begrænsninger af de optiske komponenter i pladelæseren (eller hvilken som helst måleenhed der bruges) kan også være betydelige. De fleste pladelæsere kan for eksempel ikke pålideligt måle absorbansværdier over 3, og denne begrænsning gælder uanset procentdelen af substratet, der er omdannet til produkt.
Fig 1. Selvom det ikke ellers er diskuteret i denne vejledning, skal man også være opmærksom på, at de kan denaturere over tid, især hvis de er meget fortyndede, og produkterne fra nogle reaktioner kan hæmme dem. Der er faktisk andre mulige årsager til ikke-lineær opførsel, men det er normalt relativt let at finde det lineære interval ved forsøg og fejl ved hjælp af serielle fortyndinger af f.eks.
Analysetid og temperatur
disse parametre kan også påvirke det lineære interval, da de påvirker hastigheden af substratkonvertering. For eksempel kan et assay være lineært efter 15 minutter, men ved 60 minutter kan der være forbrugt for meget substrat. I denne situation ville du nødt til at reducere mængden af FTM for at køre din assay i 60 minutter. De samme overvejelser gælder for analysetemperatur, da det også kan påvirke reaktionshastigheden.
de fleste mennesker vedtager en analysetid på et sted mellem 15 min og 60 min. 2 min), fordi en lille forsinkelse i standsning af reaktionen vil føre til en betydelig fejl i beregninger af aktivitet. Det er vigtigt at sikre, at reagenser, der opbevares i køleskab eller fryser, har ækvilibreret til den korrekte temperatur før brug, og dette er især vigtigt, hvis du har en relativt kort analysetid.
Assay Volume/Sensitivity
fra et praktisk perspektiv bestemmes / begrænses assayvolumenet af det forbrugsstof, du bruger til dine assays (f.eks. kuvetter, rør eller mikroplader). Signalet for de fleste analyser er proportionalt med analysevolumen, og forsøg på at miniaturisere analysen (f.eks. for at bevare reagenser) vil normalt føre til lavere signaler. Imidlertid er absorbansanalyser ofte en undtagelse, og en skift fra en 3 ml kuvette til 1 ml mikrokuvette ændrer for eksempel ikke absorbansaflæsningen, hvis kuvettens bredde (stilængde) stadig er 1 cm (dvs. lyset passerer stadig gennem den samme’ længde ‘ af væske). Dette skyldes, at absorbansen er proportional med Stiens længde, ikke til prøvevolumenet.
i mikropladeabsorbansanalyser er banelængden lig med væskens dybde, og det er muligt at miniaturisere uden tab af signal ved at reducere brøndens diameter og opretholde en konstant væskedybde. For eksempel kan 96 brøndplader let rumme 200ul prøve, men med et 50ul analysevolumen ville det være bedre at bruge en 384-brøndsplade til at øge banelængden over den, der ses med 50ul prøve i en 96 – brøndsplade.
kontinuerlige analyser (måling af produktets udseende over tid)
de fleste analyser udføres i en fast periode (slutpunktsanalyser), og reaktionen standses ved tilsætning af et stopreagens (f.eks. syre). I kontinuerlige analyser registreres imidlertid produktets udseende (mindre almindeligt forbrug af substrat) kontinuerligt (f. eks. ved hjælp af en kortoptager). De samme grundlæggende regler gælder; et plot af signal versus tid for en fast mængde f.eks. skal være lineær, og hastigheden skal fordobles, hvis mængden af f. eks. Så længe analysen drives i det lineære område, kan aktiviteten af passende fortyndede ‘ukendte’ bestemmes nøjagtigt ud fra de indledende reaktionshastigheder målt med et sæt standarder.
hvilken Substratkoncentration skal jeg bruge?
koncentrationen af substrat vil påvirke reaktionshastigheden, men der er flere faktorer, der skal overvejes ved valg af den ‘rigtige’ koncentration. Fra et praktisk synspunkt er en vigtig overvejelse den mængde produkt, der skal genereres for at give et målbart analysesignal. 15% af substratet er blevet hydrolyseret, bør den indledende koncentration af substratet generelt være mindst 10 gange den koncentration af produkt, der vides at give et acceptabelt analysesignal.
en anden overvejelse er KM for substratet. Mens tilføjelse af mere substrat generelt betyder, at du vil se højere aktivitetsværdier, er forholdet ikke lineært, og omkostningerne ved substratet skal muligvis overvejes. På dette tidspunkt er det sandsynligvis nyttigt at introducere den klassiske Michaelis-Menten ligning:
v = (Vmaks S)/(Km + S) ……………. EKN. (1)
hvor V er hastigheden, er Vmaks den maksimale mulige hastighed, S er substratkoncentration og Km er lig med substratkoncentrationen, der giver halv maksimal aktivitet. Afledningen af denne ligning og dens underliggende antagelser kan findes i enhver tekstbog om kinetik. Selvom det er normalt at måle snarere end at beregne hastigheden af reaktioner, er det nyttigt at forstå de underliggende principper med henblik på analysedesign.
Michaelis-Menten-ligningen er nyttig, idet den hjælper dig med at vælge en passende koncentration af substrat, hvis Km er kendt.
Når S=Km, v = (Vmaks S) / 2s, dvs.
med andre ord fungerer det med 50% af den maksimale mulige hastighed, når S=Km.
Ved at erstatte i ligning 1 værdierne for S = 10 Og Km = 1 vil du se, at ved at øge substratkoncentrationen 10 gange virker det nu på ~90% af den maksimale mulige hastighed i stedet for 50%. Det er klart, at dette er højere, men ikke 10 gange højere.
Ved meget høje koncentrationer af substrat bliver Km i ligning 1 numerisk ubetydelig, og den målte hastighed er Derefter lig med Vmaks.
mange analyser køres med substratkoncentration ved eller omkring Km-værdien, men hvis Km er meget høj, er det muligvis ikke muligt at bruge en så høj koncentration af substrat (f. eks. af hensyn til omkostninger eller begrænset opløselighed).
i nogle situationer kan det endda være tilrådeligt at anvende en relativt lav koncentration af substrat. For eksempel i farmaceutisk lægemiddelopdagelse ville brugen af en meget høj substratkoncentration gøre det vanskeligere at identificere konkurrencedygtige inhibitorer (konkurrencedygtige inhibitorer binder til det samme sted som substratet).
en balance mellem de forskellige faktorer skal slås, så analysen har et målbart signal, kan betjenes i det lineære interval og kan opfylde ethvert andet analysemål (f.eks.
Standardkurver
der kræves altid en standardkurve, hvis du ønsker at beregne aktiviteten. Det er ikke vigtigt, hvis du kun er interesseret i relative aktivitetsværdier.
standardkurven konstrueres ved at måle analysesignalet med standardopløsninger af reaktionsproduktet over et passende koncentrationsinterval. Ideelt set bør du køre en standardkurve for hvert eksperiment, men hvis standardkurven er meget reproducerbar, kan det være acceptabelt at køre det med jævne mellemrum.
en typisk standardkurve er vist i figur 2 nedenfor. Dette er en standardkurve for et ATPase-assay, hvor ATP hydrolyseres til ADP og Pi (uorganisk fosfat).
Fig 2. Standardkurve for PI
fosfatet detekteres ved hjælp af et farvestofbindende reagens, der ændrer farve ved tilstedeværelse af phosphat. Specifikationerne for denne test er imidlertid ikke vigtige her; uanset produktets art eller den anvendte detektionsmetode skal der konstrueres en standardkurve, der viser signalets afhængighed af mængden af produkt i analysen. Kurven (ideelt set er den en lige linje) bruges til at bestemme mængden af produkt, der genereres i prøver med ukendt aktivitet, dvs.fra absorbansværdien, ved at aflæse skæringspunktet på h – aksen. (De fleste grafiske programpakker vil automatisk beregne værdier af H fra målte værdier af y). Mængden af aktivitet kan derefter beregnes (se senere).
Plotter jeg koncentration eller absolut mængde på aksen?
der er ikke noget enkelt korrekt svar her, og muligheden for at bruge begge tilgange kan ofte forårsage forvirring, når aktivitetsværdier beregnes. For eksempel er det meget praktisk at plotte nmol af produktet på h-aksen, hvis du har brug for at beregne aktivitetsværdier (husk, aktivitet = nmol pr. Imidlertid fremstilles laboratoriereagenser normalt ved kendte koncentrationer, og det er ofte lettere at plotte disse værdier på h-aksen. Når du beregner aktiviteten (eller den specifikke aktivitet) af dit produkt, skal du dog huske at konvertere koncentrationen på h-aksen til antallet af dannede nmol ‘ er, hvilket betyder, at du skal tage højde for analysevolumenet. Årsagen er let at forstå: 50ul og 100ul volumener af en standardopløsning vil være i samme koncentration, men det større volumen vil indeholde dobbelt så meget produkt. Generelt er det bedst at vælge en tilgang (dvs.enten plot absolut mængde produkt eller koncentration), så den samme metode, der beregner aktivitet, altid anvendes.
kontrol og subtraktion af ‘tomme’ Data
korrekt kontrol er meget vigtig for kvantitativt arbejde, ligesom den korrekte anvendelse af kontroldataene i beregninger.kontroller fortæller dig (indirekte), hvor meget af analysesignalet der skyldes virkningen af analysen, og hvor meget der opstår af andre grunde. En almindelig kilde til ‘falsk’ signal er substratet (som ofte kan være forurenet med produkt). Andre analysekomponenter kan også give anledning til et lille signal afhængigt af komponenternes art og typen af assay. Formålet med kontrollerne er at give dig mulighed for at fjerne (ved subtraktion) alle elementer i det samlede signal, der ikke er relateret til handlingen. Hvis analysen er veldesignet, og analysereagenserne er af god kvalitet, er behandlingen af kontroller normalt ret enkel.
nogle generelle retningslinjer er angivet nedenfor:
Hvis vi vender tilbage til det kolorimetriske assay til påvisning af uorganisk fosfat, kan vi fremhæve nogle potentielle problemer, der let opdages med korrekt kontrol.0,08 i en 96-brøndsplade ved den bølgelængde, der anvendes til måling (omkring 650 nm).
Vi kan oprette følgende analyser/kontroller (aflæsninger i parentes i en hypotetisk analysesituation):
- alle analysekomponenter minus (0,5)
- på egen hånd (0,1)
- plus alle andre komponenter (1,8)
det er klart, at analysesignalet på 1,8 ikke udelukkende skyldes virkningen af.for enhver analyse er en nøglekontrol (a) at udelade koden (og erstatte den med en buffer). Dette giver dig baggrundssignalet for alle de andre analysekomponenter som en gruppe, inklusive underlaget, der kan indeholde en lille mængde produkt. Denne kontrol fortæller dig ikke baggrundssignalet, men det er klart, at du ikke kan tilføje det til underlaget som en kontrol! I de fleste analyser giver det ikke noget signal, fordi det fortyndes betydeligt før brug i analysen. Dette kan let kontrolleres, som I B ovenfor.
dataene for prøve A (ovenfor) antyder, at blandingen er forurenet med uorganisk phosphat. De enkelte komponenter kan derefter kontrolleres for at identificere kilden til problemet. Denne situation er ret almindelig for analyser af Atpaser og andre fosfatgenererende stoffer, da substraterne ofte er ustabile og delvist hydrolyseres for at give noget uorganisk fosfat.
det kan være akavet at korrigere rådata, hvis flere komponenter giver falske signaler; eliminering af problemet ved kilden er generelt langt bedre end nogen matematisk behandling. Den ‘korrigerede’ værdi for prøve C ovenfor kan synes at være 1,2 (dvs. 1.8 – 0.5 – 0.1) men strengt taget er dette forkert. Husk, at analysepladen plus detektionsreagens giver et baggrundssignal på omkring 0,08, så kilden til det meste af signalet til kontrol A er plasten på pladen og/eller detektionsreagens. Det samme lille signal skal også være skjult inden for værdien for kontrolelementet. I den ovenfor anvendte korrektion har vi således trukket dette skjulte emne to gange.
Du skal altid trække kontrolelementer fra analysedata, og det foretrækkes at kombinere alle stoffer (undtagen f.eks. Hvis denne fremgangsmåde tages, behandles standardkurven på samme måde, og en kontrolværdi trækkes fra (dvs.den værdi, der opnås i fravær af produkt, dvs. analog med pladen/reagensemnet diskuteret ovenfor). Således indeholder hverken de subtraherede analysedata eller den subtraherede standardkurve det potentielt vildledende baggrundssignal forårsaget af plade/assayreagens.
endelig, som vi har set, registreres falske signaler let med korrekt kontrol, men den bedste strategi for at få data af god kvalitet er at bruge reagenser med lav baggrund, så kontrolværdierne er lave. Det er også nyttigt at generere et analysesignal, der er langt højere end noget baggrundssignal. Ideelt set skal signal-til-baggrund-forholdet være mindst 5 og fortrinsvis 10 eller mere for nøjagtigt kvantitativt arbejde.
beregning af Aktivitetsværdier
Dette er ret let at forstå, hvis vi beregner tilbage fra rå analysedata på trinvis måde. Lad os for eksempel sige, at vi har genereret 10 nm produkt i vores reaktion (dvs.bestemt ud fra standardkurven for signal versus absolut mængde produkt). Ml, er vi nødt til at overveje tid og volumen og måske mindre åbenlyst mængden og fortyndingen af f.eks.
hvis analysen er 10 min lang, er antallet af nmol pr. min i eksemplet ovenfor 1. (trin1)
Hvis assayvolumenet er 200ul, skal vi multiplicere med 5 (dvs.1000/200) for at få nmol pr. (trin 2)
denne værdi vedrører aktiviteten af analysen i analysen, ikke i prøven af analysen, der bruges til at oprette analysen. Nogle yderligere korrektionsfaktorer er nødvendige for at bestemme aktiviteten i den oprindelige prøve.det kan være blevet fortyndet før brug, og det skal fortyndes yderligere af de andre komponenter, der er til stede i analysen. Hvis analysen (i alt 200ul) består af 20ul, og analysen er forfortyndet 1/100, før 20ul-prøven tilsættes, kan du sandsynligvis se, at vi først skal multiplicere med 10 (trin 3) og derefter med 100 (trin 4) for at få aktiviteten af stoffet i den originale opløsning.
indtil videre er dette relativt ligetil. Vi nævnte dog tidligere, at koncentrationen ofte er afbildet på standardkurvens h-akse. Værdierne kan således udtrykkes i mm-termer (ikke mmol), og du kan ikke bestemme antallet af mmol blot ved at inspicere standardkurven.
da mmol betyder mmol pr.liter, har vi en uoverensstemmelse mellem det implicitte volumen på 1L og det faktiske analysevolumen. Så hvis vi har 10 mm Produkt, og assayvolumenet er 200ul, skal vi dividere med 5000 for at få antallet af mmol af produkt.
du bemærker muligvis her, at Opdeling med 5000 her opvejer nogle af de multiplikationsoperationer, der var påkrævet ovenfor. Faktisk er det helt normalt, at korrektionsfaktorer annullerer. For eksempel i en 10 minutters analyse ved hjælp af 1/10 fortyndet, vil du dividere med 10 for at få nmol per min og multiplicere med 10 senere for at korrigere for fortyndingsfaktoren.
Det følger heraf, at hvis du altid bruger Standard assay betingelser (dvs. fra standardkurven med en enkelt global korrektionsfaktor, som omfatter alle de andre individuelle korrektionsfaktorer, for at beregne dine aktivitetsværdier. Først ved første lejlighed skal du identificere de enkelte korrektionsfaktorer.
hæmning / lægemiddelscreening
Dette er et område, hvor der fortsat er behov for at operere i det lineære område, men hvor beregninger af aktivitetsværdier normalt ikke er relevante; snarere er den relative reaktionshastighed (eller den relative mængde produkt, der dannes) i nærvær og fravær af et teststof nøglen, hvilket kræver lidt mere end enkle beregninger ved hjælp af de blind – subtraherede analysedata. Efter subtraktion af emnerne udtrykkes mængden af dannet produkt som en procentdel af den mængde, der opnås i fravær af teststoffet (dvs.100%). Disse analyser kan undertiden køres med ganske lave signal-til-baggrundsforhold, fordi det spørgsmål, der stilles – hæmmer teststoffet reaktionen?
– kræver kun et ja / nej svar.
sammendrag
denne vejledning har forhåbentlig givet klare forklaringer på ‘enhedsenheder’, ‘aktivitetsaktivitet’ og ‘specifik aktivitet’ og enhedsdefinitioner og betydningen af ‘lineært interval’. Specifikationerne for, hvad der skal plottes på standardkurvens h-akse, er et spørgsmål om brugerpræference, men der kræves en vis omhu, når aktiviteter beregnes. Analysekontroller er vigtige, men det er bedre at bruge reagenser af høj kvalitet end at fjerne baggrunde ved hjælp af matematiske tilgange. Et højt signal til baggrundsforhold er ønskeligt for kvantitativt arbejde, og et antal parametre kan varieres for at øge analysesignalet; det er ikke altid nødvendigt blot at tilføje mere. Aktivitetsværdier kan let beregnes, hvis en trinvis tilgang bruges til at identificere nøgleassayvariablerne.
se flere protokoller og vejledninger