alle metoder blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler. Informeret samtykke blev opnået fra alle emner.
materiale
følgende sølvforbindelser blev sammenlignet: Acticoat(Smith &nevø, UK; henvist til i denne artikel som Ac), Akvacel Ag + ekstra (Convatec, UK; henvist til i denne artikel som AK), Silvercel Hydro-alginat (Systageniks, UK); Ialugen Plus (IBI, Tjekkiet; i denne artikel som ia).
andre kemikalier blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), hvis ikke andet er angivet.
fremstilling af ekstrakter
i flere analyser blev ekstrakter fra forbindinger anvendt snarere end selve forbindingerne. Disse ekstrakter blev fremstillet under anvendelse af fysiologisk saltvand (0,9% (vægt/v) NaCl) eller cellekulturmedier suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS). Forholdet mellem forbindingsområdet og opløsningen var 1 cm2 pr 4 mL opløsning. Ekstraktion blev udført i 72 timer ved RT med konstant omrøring. Ekstrakterne blev steriliseret ved at føre dem gennem et 0,2 liter filter og opbevaret ved 4 liter C indtil brug.
Sølvkoncentrationsmåling
sølvkoncentrationerne i forbindinger og ekstrakterne af forbindinger blev målt ved hjælp af ICP-OES. Sølvkoncentrationen blev også evalueret i hudprøver fra svin. 10-70 mg af hver prøve blev overført til en PTFE-beholder til mikrobølgefordøjelse. Derefter 1 mL koncentreret salpetersyre (trace analysis grade, Analytika Ltd., Tjekkiet), 0.8 mL koncentreret saltsyre (trace analysis grade, Analytika Ltd., Tjekkiet) og 0,2 mL brintoverilte (p.a. 30%, Penta Ltd., Tjekkiet) blev tilføjet. Prøven blev fordøjet ved 150 liter C i 5 minutter og derefter i det andet trin i samme cyklus ved 200 liter C i 10 minutter. Efter fordøjelsen blev prøven overført kvantitativt under anvendelse af 0,2 mL brintoverilte og deioniseret vand.
analysen blev udført med et ICP-OES-instrument (Radial 725, Agilent Technologies, Australien) udstyret med en pneumatisk Havsprayforstøver og cyklonisk sprøjtekammer. Kvantificering var baseret på ekstern kalibrering. Metodens nøjagtighed og pålidelighed blev testet ved hjælp af svinehudprøver tilsat kendte koncentrationer af Ag fra en certificeret referenceopløsning (Analytika Ltd., Tjekkiet).
Scanningselektronmikroskopi
Scanningselektronmikroskopi (SEM) analyser blev udført ved hjælp af et Seiss Ultra Plus instrument (Seiss, Tyskland). Prøverne blev belagt med et tyndt lag Au/Pd i en Kvorum SC7620 sputter coater. Billeder blev taget af to sekundære InLens og SE2 elektrondetektorer til henholdsvis højere eller lavere forstørrelse. Scanningsparametre var som følger: accelerationsspænding, 3,5 kV; probestrøm, 36 pA; og tryk i kammeret, ~ 7 lod 10-5 Pa.billeder blev taget med instrumentet Ultra Plus. Røntgenkort og spektre blev taget af en røntgen-detektor på maks. 80. Accelerationsspænding, 10 kV; sondestrøm, 300 pA; arbejdsafstand, 8,5 mm; og procestid, 4 .
direkte oksidativ aktivitet af forbindinger
dannelsen af ROS under cellefrie forhold blev evalueret ved anvendelse af 3,3′,5,5′-tetramethyl-bensidin (TMB) som substrat for peberrodsperidase (HRP). Cirkler med diameter 6 mm blev skåret ud af forbindingerne og testet. Kort sagt bestod arbejdsopløsningen af 0,1 mg/mL TMB (stamopløsning c = 1 mg/mL i DMSO) blandet 1:9 med 0,05 M citrat–phosphatbuffer (pH = 5) og HRP (endelig c = 0,16 IE / mL). Hvert stykke forbinding blev nedsænket i 0,5 mL af arbejdsopløsningen, og prøver (25 liter) blev opsamlet ved 0, 5, 7,5 og 10 min. Umiddelbart efter opsamling blev prøverne blandet i forholdet 1:1 med 0,16 M H2SO4, og absorbansen blev aflæst ved 450 nm (referencebølgelængde = 540 nm) ved anvendelse af et NanoDrop OneC-instrument (ThermoFisher Scientific, US). 30% H2O2 blev anvendt som en positiv kontrol. Baggrundssignalet (tom opløsning) blev trukket fra.
sølvindtrængning i deepiteliseret hud
Vi brugte statiske diffusionsfransceller til at undersøge sølvindtrængning i deepiteliseret hud. Huden blev opnået fra et lokalt slagteri (Bocus, Letohrad, Tjekkiet) og udskåret fra den indre del af svinens auricle. Håret blev barberet, huden blev inkuberet i PBS (60 liter C, 90 s), og epidermis blev skrællet af. Den gennemsnitlige tykkelse af den deepiteliserede hud var 2 mm. hudstykkerne blev anbragt i et kammer og dækket af en testet sølvforbinding eller et stykke gasbind. Hvert donorkammer blev fyldt med 0,3 mL nhdf-dyrkningsmedium med 10% FBS. Acceptorkammeret indeholdt 0,7 mL dyrkningsmedium. Diffusionscellerne blev inkuberet ved 37 liter C i 24 eller 48 timer. Efter inkubation blev huden skyllet med PBS, og de dele af huden, der adskilte donor-og acceptorkamrene, blev analyseret for sølvindhold ved hjælp af ICP-OES, som beskrevet ovenfor. Mængden af sølv, der trængte gennem den deepiteliserede hud, blev målt i donorvæsken. Tre uafhængige replikater blev udarbejdet på begge tidspunkter.
dyrkning af eks vivo hud med forbindinger
friske (1-2 timer) porcine auricles (Bocus) blev omhyggeligt rengjort med sæbe og Betadin (en PVP jodopløsning, Egis Pharma, Ungarn) og skyllet med vand. Hudstykkerne (1 liter 1 cm) fra aurikler blev udskåret og anbragt i antibiotisk opløsning (penicillin–streptomycinopløsning, 10.000 U/mL penicillin, 10 mg/mL streptomycin) i 30 minutter ved 37 liter C under atmosfærisk O2 og CO2. Hudprøver med intakt epidermis blev anbragt dermal side opad i 6-brønds dyrkningsplader med 3 mL NHDF-medium suppleret med 10% FBS og derefter dækket med 1 liter 1 cm valgt sølvholdig dressing eller sterilt kontrolgas gennemblødt med 300 liter dyrkningsmedium. Prøverne blev inkuberet i 24 eller 48 timer. Derefter blev huden skyllet med PBS, og hver af hudeksplantaterne blev opdelt i tredjedele til histologisk undersøgelse (4% PFA − fiksering ved 4 kg C), proteinanalyse ved hjælp af vestlig blot (snapfrysning med flydende nitrogen) og kpcr (natten over i Rnalater (Thermo Fisher Scientific), derefter ved-80 kg C).
histologisk farvning
den autometallografiske farvning af sølv blev vedtaget ifølge Danscher et al.49. Billeder blev taget ved hjælp af et Eclipse 50i-mikroskop med et vedhæftet DS-Fi1-kamera (Nikon, Yokohama-Shi, Japan).til immunofluorescens af yh2aks blev histologiske sektioner på Superfrost plus glasrutschebaner (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) deparaffineret og inkuberet natten over med primært antistof (1:1.000, ANTI-PHOS-HIST H2A.S139, klon JBV301, Millipore, MA, USA). De blev derefter inkuberet i 1 time med et sekundært antistof (ab150114, Abcam, Cambridge, UK; fortynding 1:10 000) og monteret på dias med ProLong Diamond Antifade Mountant med DAPI (ThermoFisher Scientific). Billeder blev taget med et Nikon Eclipse ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japan) fluorescerende mikroskop.
genekspression
svinehud efter inkubation med forbindinger blev behandlet til RNA-isolering, cDNA-syntese og kpcr-genekspression som beskrevet tidligere af Klein et al.50 PCR-analyser i realtid (Thermo Fisher Scientific, MA, USA), der blev brugt til kpcr, var: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, SS03375596_U1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. Tærskelcyklusværdier blev normaliseret til rpl13a-husholdningsgenet og relateret til gasbindekontrolprøver for det bestemte tidspunkt (24 – eller 48-h interval) ved hjælp af 2−Kristct-Metoden51. Seks uafhængige prøver for hver behandling og tid blev målt og gennemsnitligt. Betydningen af forskelle i genekspression i forhold til gasbindekontrol blev evalueret ved hjælp af elevens t-test for hver sølvforbinding i den angivne tid.
vestlig blotting
til efterfølgende vestlig blot-analyse blev vævslysater fremstillet af frosset svineskind. Anvendelse af en skalpel i en dråbe lysisbuffer (50 mm Tris pH 8; 150 mM NaCl; 1% Triton * 100; 0,5% natriumdodecylsulfat; 1% natriumdodecylsulfat; 4% urinstof), blev huden skåret i små stykker, som efterfølgende blev homogeniseret i 350 liter af lysisbufferen ved hjælp af en 5 mm perle af rustfrit stål og en vævshomogenisator (TissueLyser II, Kiagen, Hilden, Tyskland) i 10 minutter ved 25 timer. Proteinkoncentrationen blev målt ved hjælp af BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific).
proteiner i lysater blev adskilt under anvendelse af 4-15% gradient SDS-side og overført til polyvinylidendifluoridmembraner. For at detektere specifikke proteiner blev membraner inkuberet natten over i en blokerende buffer (20 mM Tris; 137 mM NaCl; 0,05% mellem 20; 5% tørret mælkepulver med lavt fedtindhold) med det primære antistof phospho-histon H2A. h (20E3) (1: 1.000; cellesignalering, US). det blev brugt som en protein mængde loading kontrol (1: 2000; Santa Cruce, US). Membranerne blev udviklet med HRP-konjugeret anti-kanin eller anti-mus Ig Ved hjælp af kemiluminescerende detektion for at visualisere signaler (klarhed vestlige ECL substrat; Bio-Rad, US). Signalerne blev scannet og evalueret med et Alliance 9.7 Chroma Chemiluminescence Imaging System (UVItec Limited, UK).
antibakteriel aktivitet
agardiffusionsmetoden blev anvendt til at sammenligne forbindingernes antimikrobielle aktiviteter. Et prøvestykke (1 cm2) af hver forbinding blev inkuberet på en frisk podet petriskål med enten Staphylococcus aureus eller Pseudomonas aeruginosa; disse stammer blev isoleret fra humane kroniske sår, karakteriseret og dyrket som beskrevet tidligere52. Derudover blev den antimikrobielle effektivitet af bandageekstrakter (fremstillet i RPMI-medium med 10% FBS, som beskrevet ovenfor) sammenlignet ved hjælp af mikrofortyndingsmetoden53. Optisk tæthed blev målt ved en Ensight Multimode pladelæser (PerkinElmer, VALTHAM, MA, USA) ved 600 nm i 24 timer (ryster, 37 liter C).
cellekultur
normale humane dermale fibroblaster fra voksen hud (NHDF) blev købt fra Basel (Basel). NHDF blev dyrket i Dulbecco ‘ s modificerede Eagles lavt glukosemedium (DMEM) suppleret med 10% FBS, glutamin (0,3 mg/mL), glucose (4 mg/mL), penicillin (100 enheder/mL) og streptomycin (0,1 mg/mL) i 75 cm2 kulturkolber under 5% CO2 og ved 37 kg C indtil den femte passage. HaCaT keratinocytter blev købt fra H-diagnose (K-diagnose, Tyskland) og blev dyrket på samme måde, men uden tilsætning af glukose til mediet.
Levedygtighedsmåling
fem tusinde celler pr.brønd blev podet i en 96-brøndsplade med 200 liter af dyrkningsmediet med 10% FBS i en inkubator (37 liter C, 5% CO2) natten over. Den følgende dag blev cellerne behandlet med 200 liter af en fortyndingsserie af ekstrakter fra forbindingerne (100%, 50%, 20%, eller 10% af det oprindelige ekstrakt fortyndet med dyrkningsmedium suppleret med 10% FBS) i 24, 48 og 72 timer. Kontrolceller blev behandlet med et standard 10% FBS-dyrkningsmedium. Levedygtighed blev målt som beskrevet tidligere54 under anvendelse af 3-(4, 5-dimethylthiasol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrasoliumbromid (MTT) – analysen. MTT stamopløsning (20 liter; c = 5 mg/mL) blev tilsat til cellekulturmediet i hver brønd. Pladerne blev inkuberet i 2,5 timer ved 37 liter C. Derefter blev MTT-opløsningen fjernet, 220 liter lysopløsning (1:1 propan-2-ol med DMSO, 10% (vægt/v) Triton H-100 og 0,37% (vægt/v) HCl) blev tilsat, og lysis blev udført i 30 minutter ved stuetemperatur på en roterende ryster (150 o / min). Absorbansen blev læst ved 570 og 690 nm med en EnSight Multimode Plate Reader (PerkinElmer, USA). Data blev behandlet i Kaleido (PerkinElmer, USA). Den endelige absorbans blev beregnet som A = A570-A690. Ændringen i levedygtigheden af behandlede celler i forhold til kontrolceller blev beregnet som change = (en prøve/en kontrol – 1) i forhold til 100.
direkte kontaktinhiberingsassay
celler blev podet med en densitet på 300 000 celler pr.brønd i en 6-brøndsplade og inkuberet i dyrkningsmediet suppleret med 10% FBS ved 37 liter C og under 5% CO2, indtil sammenløbet blev opnået. Forbindinger blev skåret i firkanter på 1 cm2, anbragt på cellelaget og inkuberet med standardkulturmediet i 6 timer. kontrolceller blev kun behandlet med mediet. Derefter blev cellerne vasket med PBS og fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter. Cellerne blev farvet med 0,1% (vægt/v) krystalviolet opløsning (opløst i 10% ethanol) i en time og derefter skyllet med vand. Inhiberingsområderne blev fotograferet ved hjælp af et Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f digitalkamera (Canon).
fluorescerende farvning af celler
til DNA-skadesanalyse blev NHDF-celler podet på mikroskopiske dias i en 6-brøndsplade med en densitet 2 l.105 pr. brønd og fik lov til at klæbe natten over. Den følgende dag blev cellerne behandlet med 5 liter fortyndede bandageekstrakter og inkuberet i 24 timer. derefter blev cellerne fikseret under anvendelse af 4% PFA i 15 minutter. Efter permeabilisering og blokering blev objektglassene inkuberet med et primært anti-yh2aks—kaninantistof (cellesignalering, US; 1:500 fortynding i en blokerende buffer-20% FBS, 0,3 M glycin, 0,05% mellem 20 i PBS; natten over; 4 liter C). Detektion blev udført under anvendelse af et sekundært antistof mærket med Aleksa Fluor 555 (Abcam, UK; 1:500 i en blokerende buffer; 1 time, RT). Gliderne blev monteret ved hjælp af ProLong Diamond Antifade Mountant med DAPI (ThermoFisher Scientific). Efter at diasene var tørret, blev billeder taget ved hjælp af et Eclipse ti fluorescerende mikroskop (Nikon, Yokohama-Shi, Japan).
intracellulær oksidativ stress blev påvist ved anvendelse af en DCF-da-probe, som er følsom over for den samlede ROS-koncentration inde i celler. Cellerne blev podet natten over i en 24-brøndsplade og derefter mærket med DCF-da (1 liter/mL) i 15 minutter, hvorefter de blev behandlet med 5 liter fortyndede forbindingsekstrakter og inkuberet ved 37 liter C og under 5% CO2. 5 mM H2O2 blev anvendt som en positiv kontrol. Den grønne fluorescens af DCF blev registreret hvert 15. minut i løbet af en inkubationsperiode på 90 minutter ved hjælp af et Incucyte S3 automatiseret mikroskop (Essen Bioscience, USA). Kvantificeringen af intracellulær fluorescens blev udført i Fiji-programmel efter den metode, der er beskrevet af Kurpa55.
bestemmelse af neutrofiler i fuldblod
et uafhængigt etisk udvalg godkendte blodprøveindsamlingen til neutrofil oksidativ burstanalyse og MAT (etisk udvalg for forskning ved Masaryk University, Brno, Tjekkiet, godkendelse nr. EKV-2018-083). Alle donorer gav deres skriftlige samtykke.
den oksidative burst (ROS-produktion) af blodfagocytter blev bestemt i fortyndet fuldblod ved luminolforstærket kemiluminescens (CL) ved anvendelse af et lm-01T-mikropladeluminometer (Immunotech, Tjekkiet). Kort fortalt bestod reaktionsblandingen af 6 liter fuldblod i 54 liter rpmi-1640 vækstmedium blandet med 60 liter bandageekstrakt i fysiologisk saltvand eller et FBS-suppleret medium. Denne blanding blev inkuberet ved 37 liter C i 20 minutter. Lige før målingens start tilføjede vi 1 mM luminol (en stamopløsning på 10 mM luminol i en 0,2 M boratbuffer) (molekylære prober, USA). Vi bestemte spontan ROS-produktion og ROS-produktion induceret af opsoniserede partikler (OSP—0,1 mg/mL) (Sigma-Aldrich, USA) eller phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA-0,8; Sigma-Aldrich, USA). Ubehandlede prøver uden de testede ekstrakter blev vurderet som kontroller. Analyserne blev kørt i dubletter. Kemiluminescens blev registreret kontinuerligt i 90 minutter ved 37 liter C og blev udtrykt som relative lysenheder (RLU). Vi bestemte den samlede mængde ROS-produktion fra det integrerede område under kemiluminescenskurven.
monocytaktiveringstest (MAT)
MAT blev udført i 10 liter saltvandsfortyndet hepariniseret humant fuldblod. Blodprøver blev indsamlet fra fem raske donorer, samlet og fortyndet med saltvand. De fortyndede blodprøver blev inkuberet med cirkler med 6 mm diameter skåret fra forbindinger i sterile mikrotubes i 24 timer ved 37 liter C. parallelt blev lipopolysaccharid (LPS, endelig c = 0. 25 IE/mL; endotoksin Standard E-Toksat; Sigma, US) blev føjet til den anden serie af prøver inkuberet med forbindingsprøver for at stimulere et medfødt immunrespons på bakterier. Blodceller sedimenterede under inkubationen og efterlod en øvre fase af saltvandsfortyndet plasma. Efter inkubation blev 200 liter af hver saltvandsfortyndet plasmaprøve opsamlet og straks analyseret i duplikater for IL-6 ved hjælp af et IL-6 humant ubelagt ELISA-Kit i henhold til producentens protokol (ThermoFisher Scientific, US). Absorbans blev læst ved hjælp af en EnSight Multimode Plate Reader (PerkinElmer, US), og den endelige IL-6-koncentration blev beregnet af Kaleido SV (Perkin Elmer, US). De resterende plasma-og sedimenterede celler blev opbevaret ved 4 liter C til vurdering af hæmolyse og toksicitet.
hæmolyse
hæmolyse blev påvist i det resterende saltvandsfortyndede plasma og sedimenterede celler fra MAT. Efter centrifugering blev 100 liter af hver prøve overført til en 96-brønds mikroplade, og absorbansen blev målt ved 550 nm. 1% Triton H-100 blev anvendt som en positiv kontrol.
LDH-frigivelse
toksiciteten af sølvforbindelser til blodceller blev vurderet ved hjælp af lactatdehydrogenase (LDH) assay (Cytotoksicitetsdetektion KitPLUS, Roche, Sverige) i henhold til producentens anvisninger. To kilder til blodlegemer blev brugt-humant fuldblod inkuberet med sølvforbindelser som i MAT og isolerede neutrofiler. Absorbansen anvendt til baggrundskorrektion blev målt i blanke prøver uden LDH-reagenset. Resultaterne rapporteres som absolutte værdier af optisk densitet sammenlignet med en ubehandlet prøve.
statistisk analyse
Hvis ikke andet er angivet, blev Student t-testen brugt til at evaluere den statistiske signifikans af forskelle mellem prøver og ubehandlede kontroller.