Das Aufkommen der aeroben Biologie wurde vor etwa zwei Milliarden Jahren angekündigt, als primitive Cyanobakterien die Fähigkeit entwickelten, Wasser zu photooxidisieren. Sauerstoff wurde als Abfallprodukt freigesetzt, und der atmosphärische O2-Gehalt stieg schnell an. Dieser schnelle Wechsel zu einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre führte zu einem verheerenden Schadstoff, aber schließlich entwickelten sich Organismen, die von der starken treibenden Kraft für die O2-Reduktion profitierten. Enzymaktive Stellen, die in der Lage waren, Sauerstoff zu binden und zu aktivieren, entwickelten sich, und neue Klassen der Biochemie, die O2 als thermodynamische Senke verwenden, um ansonsten ungünstige Reaktionen voranzutreiben, wurden möglich. Die Effizienz des Lebensmittelstoffwechsels hat sich dramatisch verändert. Die Menge an ATP, die beispielsweise durch aerobe Metabolisierung von Glucose produziert werden könnte, stieg fast um das 20-fache. Eukaryoten erschienen kurz nach der Sauerstoffatmosphäre und wurden schließlich von der vielfältigen Vielfalt mehrzelliger Organismen gefolgt, die heute existieren. In unserer aeroben Biochemie wird O2 in einer Vielzahl synthetischer Reaktionen verwendet, die für fast alle Aspekte des Zellwachstums, der Entwicklung und der Reproduktion von grundlegender Bedeutung sind.
Trotz seiner biochemischen Vielseitigkeit >95% des Sauerstoffs, den wir verbrauchen, wird bei der Atmung verwendet. Energiereiche Elektronen, die aus der Nahrung stammen, durchlaufen die mitochondriale Elektronentransportkette in einer Reihe von exergonischen Redoxreaktionen. Diese energiereichen Elektronentransfers werden verwendet, um den chemisosmotischen Protonengradienten zu entwickeln, der letztendlich ATP produziert. Sauerstoff ist der letzte Elektronenakzeptor in dieser Atmungskaskade, und seine Reduktion zu Wasser wird als Vehikel verwendet, um die mitochondriale Kette von niederenergetischen, verbrauchten Elektronen zu reinigen. Das Enzym, das diesen Prozess katalysiert, Cytochromoxidase, überspannt die Mitochondrienmembran. Es bindet, aktiviert und reduziert bis zu 250 Moleküle O2 pro Sekunde und koppelt die dabei freigesetzte Energie an die Translokation von Protonen, die zum chemiosmotischen Gradienten beitragen. Der Mechanismus, durch den Cytochromoxidase diese bemerkenswerte Chemie katalysiert, wurde intensiv untersucht. Die in dieser Ausgabe von Fabian, Wong, Gennis und Palmer berichteten Ergebnisse liefern neue Einblicke in diesen Prozess und unterstützen die wachsende Vorstellung, dass es vereinheitlichende Konzepte für die Art und Weise gibt, wie sauerstoffverwertende Enzyme O2 für die Spaltung und Reduktion von O⩵ O-Bindungen aktivieren (1).
Die Reduktion von O2 in der Cytochromoxidase erfolgt unter strengen Einschränkungen. Der Prozess findet mit geringem Überpotential statt, die Freisetzung von teilweise reduzierten, toxischen Sauerstoffzwischenprodukten aus dem aktiven Zentrum wird minimiert, und die bei der O2-Reduktion verfügbare freie Energie wird mit hoher Effizienz an die Protonentranlokation gekoppelt (2, 3). Das Enzym arbeitet unter diesen Einschränkungen, indem es ein Häm-Fe, genannt Häm a3, und ein Kupferion, genannt CuB, in einem zweikernigen Zentrum verwendet, in dem O2 bindet und reduziert wird (siehe Abb. Abb.1).1). Der Elektroneneintrag in diese Stelle erfolgt von Cytochrom c über ein zweites Hämeisen, Häm a, und ein zweites Kupferzentrum, CuA. Kürzlich haben Yoshikawas Gruppe (4) und Michels Gruppe (5) unabhängig voneinander und gleichzeitig Kristallstrukturen des Enzyms bereitgestellt, die tiefe Einblicke in viele Aspekte des katalytischen Zyklus gegeben haben, insbesondere wie Protonen und Sauerstoff sich wahrscheinlich durch das Protein bewegen. Der Mechanismus der O2-Reduktion durch Oxidase wurde von einer Reihe von Gruppen mit einer Vielzahl von spektroskopischen Techniken verfolgt (für Reviews siehe Refs. 6 und 7). Aus dieser Arbeit kann eine vereinfachte Reaktionssequenz, die transiente, aber nachweisbare Zwischenprodukte am zweikernigen Zentrum beinhaltet, wie folgt geschrieben werden (siehe auch Abb. Abb.2):2):
Insbesondere die P- und F-Spezies haben Aufmerksamkeit erregt, da sie an dem Pumpmechanismus beteiligt sind, der die Protonentranlokation antreibt (8). Jüngste Arbeiten von Michel (9) und von Wikström und Mitarbeitern (10) haben sowohl den Fortschritt als auch die Unsicherheiten in unserem Verständnis des Mechanismus hervorgehoben, der exergonische Elektronentransfers an Sauerstoff mit endergonischer Protonenbewegung über die Membran koppelt.
Das zweikernige Zentrum in der Cytochromoxidase. Häm a3 und CuB sind zusammen mit dem proximalen Liganden für das Hämeisen H376 und dem CuB-Liganden H240 gezeigt, der mit Y244 vernetzt ist (24, 25). Die O2-Bindung und -Reduktion erfolgt im Bereich zwischen a3-Eisen und CuB.
Ein vereinfachtes Schema für die Reaktion zwischen Cytochromoxidase und O2. Die zweikernige Stelle, die Häm a3, CuB und die vernetzte H240 – Y244 (H-Y) -Struktur enthält, ist gezeigt. Reduktion und Protonierung der oxidierten Form des Zentrums erzeugt die reduzierte Stelle. Dieses bindet O2, um zuerst die Oxyspezies zu bilden, die weiter reagiert, um P- und F-Vermittler zu produzieren, bevor es die oxidierte Form des Enzyms regeneriert. Die Reduktion von P und F wird, wie angegeben, durch Protonentransferreaktionen begrenzt. Die Schritte zwischen P und der reduzierten Form der Stelle wurden an Protonenpumpprozessen beteiligt, die durch rote Pfeile angezeigt werden. Die Stöchiometrie dieser Schritte ist Gegenstand aktueller Untersuchungen, obwohl während des gesamten Zyklus bis zu vier Protonen gepumpt werden können.
Ein anhaltendes Problem bei der Entschlüsselung der Sauerstoffchemie im zweikernigen Zentrum der Cytochromoxidase und ihrer Verknüpfung mit der Protonenpumpe besteht darin, die molekularen Strukturen der Zwischenprodukte im obigen Schema zu bestimmen. Es besteht Konsens, dass das F-Intermediat ein Ferryl-Oxo-Intermediat bei Häm a3, a34 +⩵O beinhaltet (3, 6, 11, 12), die Struktur von P war jedoch Gegenstand erheblicher Kontroversen. Die anfänglichen Zuordnungen dieser Spezies postulierten, dass sie eine intakte Bindung enthielt, a33 + —O2⩵ Spezies, daher seine Bezeichnung als P für „Peroxy“ (z. B. Refs. 3, 8 und 13). Weng und Baker interpretierten ihre optischen Daten jedoch so, dass eine O⩵ O-Bindungsspaltung bereits bei P stattgefunden hatte und dass auch diese Spezies eine a34 +⩵O-Struktur im zweikernigen Zentrum aufwies (14). Diese Schlussfolgerung wurde anschließend durch mehrere spektroskopische Untersuchungen gestützt (15-17). Kitagawa, Proshlyakov und ihren Mitarbeitern gelang es, mithilfe der Raman-Spektroskopie die Dehnungsbewegung a34 +⩵O (18, 19) in einer Form von P nachzuweisen, die durch Zugabe von Peroxid zum oxidierten Enzym erzeugt wurde. Nachfolgende Arbeiten zeigten, dass die gleiche Vibration beobachtet werden kann, wenn Sauerstoff zu einer Zwei-Elektronen-reduzierten Form des Enzyms hinzugefügt wird, was bestätigt, dass die Sauerstoffchemie und die Peroxidchemie in der Oxidase durch gemeinsame Zwischenprodukte ablaufen (20). Darüber hinaus zeigte der zeitliche Verlauf des Auftretens von P in dieser Arbeit, dass diese Spezies kinetisch kompetent ist (siehe auch Refs. 21 und 22). Aus der spektroskopischen Arbeit und auch aus der jüngsten Computerarbeit (23) geht daher hervor, dass P tatsächlich eine O⩵ O-bindungsgespaltene Spezies ist.
Die von Fabian et al. (1) liefert neue, unabhängige und überzeugende Beweise dafür, dass die O⩵ O-Bindung in Cytochromoxidase auf P-Ebene gespalten wird. In ihren Experimenten argumentierten sie, dass kein Sauerstoffatom in einer Bindung-intakten Peroxystruktur wahrscheinlich mit Lösungsmittelwasser austauscht. Wenn P jedoch als a34+⩵O-Spezies auftritt, dann erwartet man, dass das zweite Sauerstoffatom wahrscheinlich auf der Ebene von Hydroxid oder Wasser liegt und dass sich dieser Sauerstoff im wässrigen Puffer gut mit Wasser austauschen kann. Unter Verwendung von 18O2 als Substrat in einem wässrigen Puffer, der H216O enthielt, fingen sie das P-Zwischenprodukt ein und untersuchten das Auftreten von H218O. Ihre massenspektrometrischen Ergebnisse zeigen deutlich, dass ein einzelnes Sauerstoffatom aus dem 18O2-Substrat mit Lösungsmittelwasser austauschbar ist, in ausgezeichneter Übereinstimmung mit ihrer obigen Analyse und der Zuordnung von P als bindungsgespaltene Ferryl-Oxo-Spezies.
Die Erkenntnis, dass P eine a34+⩵O-Struktur hat, hat eine Reihe wichtiger Implikationen. Die Umwandlung von gebundenem O2 in der Oxy-Spezies zu Hydroxid (oder Wasser) und einem Ferryl-Oxo in P erfordert insgesamt vier Elektronen. Im zweikernigen Zentrum sind jedoch nur drei leicht verfügbar – zwei von Häm a3, wenn es vom +2- in den +4-Valenzzustand übergeht, und eines von CuB, wenn es von Kupfer zu Kupfer oxidiert wird. Die Quelle des vierten Elektrons ist unklar. Die Oxidation des Häm-Makrozyklus, wie sie in Verbindungen I in einigen Peroxidasen auftritt, kann aufgrund von Raman und optischen Daten eliminiert werden (6, 7), und Cu3+ wurde in biologischem Milieu nicht nachgewiesen. Der wahrscheinlichste Kandidat ist also eine redoxaktive Proteinseitenkette, wie sie in der Cytochrom-c-Peroxidase vorkommt, in der Tryptophan redoxaktiv ist, oder in der Prostaglandinsynthase, die einen oxidierbaren Tyrosinrest enthält (24). Yoshikawa und Mitarbeiter (25) lieferten auffällige kristallographische Beweise, die das Auftreten einer redoxaktiven Seitenkette stark unterstützen. Sie zeigten, dass Y244 im zweikernigen Zentrum mit einem der CuB-Liganden, H240, vernetzt ist und dass die Phenolkopfgruppe so ausgerichtet ist, dass die −OH-Gruppe direkt in den O2-Bindungshohlraum zeigt (Abb. (Abb.1).1). Michel hat ähnliche kristallographische Daten berichtet (26), und Buse und Mitarbeiter haben kürzlich biochemische Daten berichtet, die das Auftreten der H240-Y244-Vernetzung unterstützen (27). Neuere EPR-Daten wurden ebenfalls berichtet, die auf das Vorhandensein von Tyrosylradikalen hinweisen, wenn Peroxid dem Ruheenzym zugesetzt wird, obwohl die spezifischen beteiligten Seitenketten nicht identifiziert wurden (28, 29). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse stark darauf hin, dass das vernetzte Tyrosin die Quelle des vierten Elektrons bei der Aktivierung und Reduktion von O2 durch Cytochromoxidase ist. Diese Vermutung führt zu dem vereinfachten Reaktionsablauf in Fig. Abb.2,2, in der die vernetzte H-Y-Struktur explizit gezeigt ist und vorgeschlagen wird, zum neutralen Tyrosylrest im P-Zwischenprodukt zu oxidieren.
Das Schema in Abb. Abb.22 hebt die Analogien zwischen Cytochromoxidase und den Peroxidasen und Katalasen in Bezug auf die Sauerstoff–Sauerstoff-Bindungsspaltchemie und in Bezug auf die Produkte hervor, die aus der Reaktion resultieren. In der Oxidase extrahiert das Enzym drei Elektronen aus Metallen im aktiven Zentrum und ein viertes Elektron aus einer organischen Einheit, um O2 in einem Schritt zu O⩵ und OH— zu reduzieren. Beide Produkte befinden sich auf der Ebene von Wasser, obwohl eine weitere Protonierung und Freisetzung erst in späteren Reaktionsschritten erfolgt. In Peroxidasen und Katalasen extrahiert das Enzym ein Elektron aus einem Metall im aktiven Zentrum und ein zweites Elektron aus einer organischen Einheit, um H2O2 in einem Schritt zu O⩵ und OH— zu reduzieren. In Peroxidasen und Katalasen ist das unmittelbare Produkt dieser Chemie Verbindung I, die eine Ferryloxo-Spezies und einen organischen Rest enthält. Diese Strukturen sind genau analog zu der a34 +⩵O / Radikalstruktur, die in P in Cytochromoxidase auftritt. Der organische Rest in Verbindung I wird in einem nachfolgenden Schritt in den Enzymen Peroxidase und Katalase zu Verbindung II reduziert, die die Ferryl-Oxo-Struktur beibehält. In der Oxidase tritt die gleiche Chemie auf, um das F-Zwischenprodukt herzustellen. Die Ähnlichkeit in der Chemie der sauerstoffmetabolisierenden Häm-Proteine ist erst mit der Realisierung der a34 +⩵O-Struktur für P entstanden und legt nahe, dass andere sauerstoffmetabolisierende Enzyme der gleichen Art von Chemie bei der Aktivierung und Reduktion von Sauerstoff und Peroxiden folgen können.
Eine interessante Strategie ergibt sich aus Abb. Abb.22 in Bezug darauf, wie Oxidase Sauerstoffchemie an die Protonenpumpe koppelt. Die Pumpschritte erfolgen erst nach Bildung von P (8-10), was bedeutet, dass das Enzym zunächst O2 aktiviert und zu vollständig reduzierten, aber unvollständig protonierten Produktwassermolekülen reduziert; das Enzym vervollständigt den Vier-Elektronen-Transfer von Elektronen zu Sauerstoff und speichert die freie Energie, die als hochoxidierende a34 +⩵O- und Radikalspezies resultiert, bevor die Pumpe eingeschaltet wird. Neuere Berechnungen zur Bindungsspaltchemie unterstützen diese Idee, da die Ergebnisse darauf hindeuten, dass die Reduktion von O2 zu Oxo und Hydroxo unter Bildung eines Radikals und eines Ferryloxos nahe an thermoneutral liegt (23). Dies stellt eine bemerkenswert effektive Strategie zur Vermeidung toxischer, teilweise reduzierter Sauerstoffspezies dar, da im Reaktionskreislauf keine vorkommen. Darüber hinaus scheint es durch die Übertragung der freien Energie, die zum Antreiben der Pumpe von untergeordneten Sauerstoffprodukten auf das Protein verwendet wird, so zu sein, als hätte die Oxidase die Kontrolle und Effizienz maximiert, mit der sie den Protonen-Translokations-Apparat betreiben kann.