El advenimiento de la biología aeróbica fue anunciado hace unos dos mil millones de años, cuando las cianobacterias primitivas desarrollaron la capacidad de fotooxidar el agua. El oxígeno se liberaba como producto de desecho, y los niveles atmosféricos de O2 aumentaban rápidamente. Este rápido cambio a una atmósfera oxigénica introdujo un contaminante devastador, pero finalmente los organismos evolucionaron aprovechando la fuerte fuerza impulsora para la reducción de O2. Los sitios activos enzimáticos que eran capaces de unirse y activar el oxígeno evolucionaron, y se hicieron posibles nuevas clases de bioquímica que utilizan el O2 como sumidero termodinámico para impulsar reacciones de otro modo desfavorables. La eficiencia del metabolismo de los alimentos cambió drásticamente. La cantidad de ATP que se podría producir metabolizando la glucosa aeróbicamente, por ejemplo, aumentó casi 20 veces. Los eucariotas aparecieron poco después de la atmósfera oxigénica y finalmente fueron seguidos por la diversa gama de organismos multicelulares que existen hoy en día. En nuestra bioquímica aeróbica, el O2 se utiliza en una gran cantidad de reacciones sintéticas que son fundamentales para casi todos los aspectos del crecimiento, desarrollo y reproducción celular.
A pesar de su versatilidad bioquímica, >el 95% del oxígeno que consumimos se utiliza en la respiración. Los electrones de alta energía derivados de los alimentos atraviesan la cadena de transporte de electrones mitocondriales en una serie de reacciones redox exergónicas. Estas transferencias de electrones energéticamente descendentes se utilizan para desarrollar el gradiente de protones quimisosmóticos que en última instancia produce ATP. El oxígeno es el aceptor final de electrones en esta cascada respiratoria, y su reducción a agua se utiliza como vehículo para limpiar la cadena mitocondrial de electrones gastados de baja energía. La enzima que cataliza este proceso, la citocromo oxidasa, se extiende por la membrana mitocondrial. Se une, activa y reduce hasta 250 moléculas de O2 por segundo y acopla la energía liberada en este proceso a la translocación de protones que contribuyen al gradiente quimiosmótico. El mecanismo por el cual la citocromo oxidasa cataliza esta notable química ha sido estudiado intensamente. Los resultados reportados en este número por Fabian, Wong, Gennis y Palmer proporcionan una nueva visión de este proceso y apoyan la creciente noción de que existen conceptos unificadores para la forma en que las enzimas que utilizan oxígeno activan el O2 para la escisión y reducción del enlace O O O (1).
La reducción de O2 en la citocromo oxidasa ocurre bajo restricciones severas. El proceso se lleva a cabo con poco exceso de potencial, la liberación de intermedios de oxígeno tóxicos parcialmente reducidos desde el sitio activo se minimiza, y la energía libre disponible en la reducción de O2 se combina con una alta eficiencia de translocación de protones (2, 3). La enzima opera bajo estas restricciones mediante el uso de un heme Fe, llamado heme a3, y un ion de cobre, llamado CuB, en un centro binuclear en el que el O2 se une y se reduce (ver Fig. Higo.1).1). La entrada de electrones a este sitio se produce desde el citocromo c a través de un segundo hemo de hierro, hemo a, y un segundo centro de cobre, CuA. Recientemente, el grupo de Yoshikawa (4) y el grupo de Michel (5) proporcionaron de forma independiente y simultánea estructuras cristalinas de la enzima que han dado una visión profunda de muchos aspectos del ciclo catalítico, particularmente de cómo es probable que los protones y el oxígeno se muevan a través de la proteína. El mecanismo de reducción de O2 por oxidasa ha sido perseguido por varios grupos con una variedad de técnicas espectroscópicas (para revisiones, ver referencias. 6 y 7). A partir de este trabajo, una secuencia de reacción simplificada que involucra intermedios transitorios, pero detectables, en el centro binuclear se puede escribir de la siguiente manera (véase también la Fig. Higo.2):2):
La P y la F de las especies, en particular, han atraído la atención, ya que han sido implicados en el mecanismo de bombeo que impulsa la translocación de protones (8). Trabajos recientes de Michel (9) y de Wikström y compañeros de trabajo (10) han puesto de relieve tanto el progreso como las incertidumbres en nuestra comprensión del mecanismo que acopla las transferencias de electrones exergónicos al oxígeno con el movimiento de protones endergónicos a través de la membrana.
El centro binuclear en la citocromo oxidasa. El hemo a3 y el CuB se muestran junto con el ligando proximal para el hierro del hemo, H376, y el ligando del CuB, H240, que está reticulado a Y244 (24, 25). La unión y reducción de O2 ocurre en la región entre el hierro a3 y el cachorro.
Un régimen simplificado para la reacción entre la citocromo oxidasa y O2. Se muestra el sitio binuclear, que contiene hemo a3, CuB y la estructura reticulada H240-Y244 (H – Y). La reducción y protonación de la forma oxidada del centro produce el sitio reducido. Esto une el O2 para formar inicialmente la especie oxi, que reacciona aún más para producir intermedios P y F, antes de regenerar la forma oxidada de la enzima. La reducción de P y F está limitada por reacciones de transferencia de protones, como se indica. Los pasos entre P y la forma reducida del sitio se han implicado en los procesos de bombeo de protones, que se indican con flechas rojas. La estequiometría de estos pasos es una cuestión de investigación actual, aunque se pueden bombear hasta cuatro protones durante el ciclo completo.
Un problema continuo al desentrañar la química del oxígeno en el centro binuclear en la citocromo oxidasa y su enlace a la bomba de protones es establecer las estructuras moleculares de los intermedios en el esquema anterior. Hay consenso en que el intermedio F implica un intermedio ferril-oxo en el hemo a3, a34+O O (3, 6, 11, 12), pero la estructura de P ha sido objeto de considerable controversia. Las asignaciones iniciales de esta especie postularon que contenía un enlace intacto, especie a33+ – O2⩵, de ahí su designación como P para «peroxi» (por ejemplo, refs. 3, 8 y 13). Weng y Baker, sin embargo, interpretaron sus datos ópticos para indicar que la escisión del enlace O O O ya había ocurrido en P y que esta especie, también, tenía una estructura a34+⩵O en el centro binuclear (14). Esta conclusión fue apoyada posteriormente por varias investigaciones espectroscópicas (15-17). Kitagawa, Proshlyakov y sus compañeros de trabajo lograron usar la espectroscopia Raman para detectar el movimiento de estiramiento a34 + ⩵O (18, 19) en una forma de P generada mediante la adición de peróxido a la enzima oxidada. El trabajo posterior mostró que se podía observar la misma vibración cuando se agrega oxígeno a una forma reducida de dos electrones de la enzima, confirmando que la química del oxígeno y la química del peróxido en la oxidasa proceden a través de intermedios comunes (20). Además, el curso temporal de la aparición de P en este trabajo mostró que esta especie es cinéticamente competente (véase también refs. 21 y 22). Por lo tanto, a partir del trabajo espectroscópico, y también del trabajo computacional reciente (23), la visión emergente es que P es de hecho una especie de enlace roto O O O.
El trabajo reportado por Fabian et al. (1) proporciona evidencia novedosa, independiente y convincente de que el enlace O O O está escindido en la citocromo oxidasa a nivel P. En sus experimentos, razonaron que ninguno de los átomos de oxígeno en una estructura peroxi intacta es probable que se intercambie con agua solvente. Sin embargo, si P ocurre como la especie a34+⩵O, entonces se espera que el segundo átomo de oxígeno esté probablemente al nivel de hidróxido o agua y que este oxígeno pueda intercambiarse con agua en el tampón acuoso. Usando 18O2 como sustrato en un tampón acuoso que contenía H216O, atraparon el intermedio P y analizaron la aparición de H218O. Sus resultados espectrométricos de masas muestran claramente que un solo átomo de oxígeno del sustrato 18O2 es intercambiable con agua solvente, en excelente acuerdo con su análisis anterior y la asignación de P como una especie ferriloxo hendida en enlace.
La comprensión de que P tiene una estructura a34 + ⩵O tiene una serie de implicaciones importantes. La transformación del O2 unido en la especie oxi en hidróxido (o agua) y un ferril-oxo en P requiere un total de cuatro electrones. Solo tres, sin embargo, están fácilmente disponibles en el centro binuclear: dos del hemo a3, ya que va del estado de valencia +2 al +4, y uno del CuB, ya que se oxida de cuproso a cúprico. La fuente del cuarto electrón no está clara. La oxidación del macrociclo del hemo, como ocurre en los compuestos I en algunas peroxidasas, se puede eliminar sobre la base de Raman y datos ópticos (6, 7), y no se ha detectado Cu3+ en el medio biológico. El candidato más probable, entonces, es una cadena lateral de proteína activa redox, como ocurre en la peroxidasa del citocromo c, en la que el triptófano es activo redox, o en la prostaglandina sintasa, que contiene un residuo de tirosina oxidable (24). Yoshikawa y sus compañeros de trabajo (25) proporcionaron evidencia cristalográfica sorprendente que apoya firmemente la aparición de una cadena lateral activa redox. Mostraron que Y244 en el centro binuclear está reticulado a uno de los ligandos del CuB, H240, y que el grupo de cabeza de fenol está orientado de modo que el grupo-OH apunta directamente a la cavidad de unión de O2 (Fig. (Higo.1).1). Michel ha reportado datos cristalográficos similares (26), y Buse y sus compañeros de trabajo han reportado recientemente datos bioquímicos que apoyan la aparición del enlace cruzado H240-Y244 (27). También se han reportado datos recientes de EPR que indican la presencia de radicales tirosílicos cuando se agrega peróxido a la enzima en reposo, aunque no se han identificado las cadenas laterales específicas involucradas(28, 29). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que la tirosina reticulada es la fuente del cuarto electrón en la activación y reducción de O2 por la citocromo oxidasa. Esta conjetura conduce al ciclo de reacción simplificado de la Fig. Higo.2,2, en el que la estructura H-Y reticulada se muestra explícitamente y se propone oxidarse al radical tirosílico neutro en el intermedio P.
El esquema de la Fig. Higo.22 destaca las analogías entre la citocromo oxidasa y las peroxidasas y catalasas en términos de química de escisión del enlace oxígeno–oxígeno y en términos de los productos que resultan de la reacción. En la oxidasa, la enzima extrae tres electrones de metales en el sitio activo y un cuarto electrón de una fracción orgánica para reducir el O2 en un paso a O⩵ y OH -. Ambos productos se encuentran al nivel del agua, aunque la protonación y liberación adicionales solo se producen en pasos posteriores de la reacción. En las peroxidasas y catalasas, la enzima extrae un electrón de un metal en el sitio activo y un segundo electrón de una fracción orgánica para reducir el H2O2 en un paso a O⩵ y OH—. En peroxidasas y catalasas, el producto inmediato de esta química es el compuesto I, que contiene una especie ferril-oxo y un radical orgánico. Estas estructuras son exactamente análogas a la estructura a34 + ⩵O/radical que ocurre en P en la citocromo oxidasa. El radical orgánico en el Compuesto I se reduce en un paso posterior en las enzimas peroxidasa y catalasa para producir el Compuesto II, que mantiene la estructura ferril-oxo. En la oxidasa, se produce la misma química para producir el intermediario F. La similitud en la química de las proteínas heme metabolizadoras de oxígeno solo ha surgido con la realización de la estructura a34+⩵O para P y sugiere que otras enzimas metabolizadoras de oxígeno pueden seguir el mismo tipo de química en la activación y reducción de oxígeno y peróxidos.
Una estrategia interesante surge de la Fig. Higo.22 en términos de cómo la oxidasa acopla la química del oxígeno a la bomba de protones. Los pasos de bombeo solo ocurren después de que se ha formado P (8-10), lo que significa que la enzima primero activa y reduce el O2 a moléculas de agua de producto completamente reducidas pero incompletas; la enzima completa la transferencia de cuatro electrones de electrones al oxígeno, y almacena la energía libre que resulta como a34+⩵O altamente oxidante y especies radicales, antes de activar la bomba. Cálculos recientes sobre la química de la escisión del enlace apoyan esta idea, ya que los resultados indican que la reducción de O2 a oxo e hidroxo con la formación de un radical y un ferril-oxo está cerca de la termoneutral (23). Esto representa una estrategia notablemente efectiva para evitar especies tóxicas de oxígeno parcialmente reducidas, ya que no ocurren en el ciclo de reacción. Además, al transferir la energía libre que se utilizará para impulsar la bomba desde los productos de oxígeno de la subestación a la proteína, parece que la oxidasa ha maximizado el control y la eficiencia con los que puede operar el aparato de translocación de protones.