tanácsadója azt mondja, hogy azt akarja, hogy használja a HPLC-t a vegyület elemzéséhez. Tudod, hogy már hallottál erről a technikáról, de nem emlékszel arra, hogy mit jelent a HPLC, nem is beszélve arról, hogyan kell csinálni! Mindannyian jártunk már ott, és fogadok, hogy azt kívántad, bárcsak több figyelmet fordítottál volna arra az előadásra!
ne félj-ebben a cikksorozatban emlékeztetni fogom Önt a HPLC oszlop hatalmáról
ebben az első cikkben végigvezetem Önt a HPLC mögött meghúzódó elven, és emlékeztetem annak felhasználására – hamarosan készen áll a laboratóriumra!
hogyan fejti ki hatását a HPLC?
a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia vagy a HPLC egy erőteljes technika hosszú neve, amely azon az egyszerű tényen alapul, hogy az egyes vegyületek másképp viselkednek a vízben.
a HPLC elválasztja és tisztítja a vegyületeket a polaritásuk, vagy a víz kedvelésére vagy ellenszenvére való hajlamuk szerint. A polaritás kontextusba helyezéséhez vegye figyelembe, hogy az olaj apoláris folyadék, amely nem keveredik a vízzel. Az etanol viszont poláris, és mint sokan tudják, nagyon jól keveredik a vízzel (Vodka és koksz bárki??).
megpróbáltam egyszerűsíteni az egész folyamatot az alábbi 1. ábrán, de először nézzük meg a HPLC fő összetevőit. Előre elnézést kérek néhány elkerülhetetlen zsargonért!
A komponensek
a HPLC oszlop
ezt állófázisnak is nevezik. Ez a HPLC gép munkalovja, különféle anyagokból (gyakran szilícium-dioxidból) készül, és nagyon kompakt jellegű. A szilícium-dioxid részecskéket hosszú szénláncok funkcionálják. A szénláncok apolárisak, ezért minél hosszabb a lánc, annál apolárisabbá válik az oszlop. A 18 szénláncot tartalmazó oszlopokat általában C18 oszlopoknak nevezik.
a HPLC minta
a Mintatípusok nagymértékben eltérnek a kérdéses terület és a vegyületek típusától függően. A HPLC felhasználható biológiai mintákban (vizelet, vér, nyál és izom), környezeti mintákban, gyógyászati kémiában (gyógyszerek) és mikrobiológiában (gombák és baktériumok által termelt toxinok) lévő vegyületek elemzésére.
A minta befecskendezése
a mintákat a HPLC oszlopba injektáljuk. Ezt korábban manuálisan hajtották végre, ami azt jelenti, hogy néhány szegény léleknek órákig kellett ülnie a HPLC gép mellett, minden mintát fecskendővel injektálva, néha egész éjjel!
szerencsére az újabb modellek automatikus befecskendezővel rendelkeznek, ami csökkenti a kézi bemenetet és nagyobb áteresztőképességet tesz lehetővé. A Modern gépek olyan szoftverrel vannak felszerelve, amely lehetővé teszi a felhasználó számára, hogy beírja a minták listáját, mennyit és milyen sorrendben kell beadni őket. Így élvezheti az ebédet, miközben a HPLC fut magát!
A mozgófázis
Ez valójában csak víz és szerves oldószer (általában acetonitril vagy metanol) keveréke. A mobil fázis azért kapja a nevét, mert áthalad az oszlopon, ugyanakkor eluálja (vagy kiöblíti) a vegyületeket az oszlopból.
a vegyületeket gyakran koncentrációgradiens mentén eluálják. Ha olyan vagy, mint én, a koncentráció és a gradiens két szó, amit utálsz látni, hogy egy mondatban jön össze! Ez csak azt jelenti, hogy a víz százalékos aránya a mobil fázisban idővel csökken, míg az apoláris oldószer százalékos aránya egyidejűleg növekszik. Ez azt jelenti, hogy a mobil fázis fokozatosan apolárisabbá válik. Egyelőre ne aggódjon túl sokat a színátmenetek miatt, mivel ezek ismét megjelennek egy követő cikkben.
a HPLC futtatása
a HPLC több módban is végrehajtható. A leggyakrabban használt módszer fordított fázisú (RP-HPLC), és ez az, amit itt leírok. Ebben a módban a vegyületeket a legpolárisabbtól kezdve az apoláris vegyületekig elválasztjuk. Minden üzemmódban egy nagy teljesítményű szivattyú mozgatja a mintát és a mobil fázist az oszlopon keresztül. Egy tipikus futás 10-60 percet vehet igénybe.
a HPLC mögötti elv-közelebbről
most, hogy van ötlete az érintett komponensekről, térjünk át az elvre egy kicsit részletesebben.
már említettem, hogy a HPLC polaritás alapján választja el a vegyületeket. De hogyan működik ez valójában? Angolul kérem! Ahogy a gradiens beindul, az oldószer koncentrációja növekszik, míg a víz koncentrációja csökken. Ez a mobil fázist egyre apolárisabbá teszi. A mintában lévő vegyületek az oszlopban lévő szénláncokhoz tapadnak, a legtöbb apoláris vegyület a legerősebb, a legtöbb poláros vegyület pedig gyengén tapad.
az 1. ábra azt mutatja, hogy mi történik egy vegyületkeveréket tartalmazó mintával az oszlopba történő befecskendezés után. A vegyületek az oszlophoz kötődnek, és különböző időpontokban kiöblítik őket, attól függően, hogy nagyobb valószínűséggel tapadnak-e az oszlophoz vagy a mozgó fázishoz, amikor átpumpálják. Az az idő, amelyet az egyes vegyületek elutálnak (vagy kiürülnek) az oszlopból, az adott vegyület retenciós idejének (Rf) nevezik.
1.ábra: a HPLC mögött meghúzódó elv
1. ábra: különböző polaritású vegyületeket (a kék sötétebb árnyalataként jelölve) injektálnak a HPLC oszlopba (teljes henger). A mozgó fázist az oszlopon keresztül pumpálják, és az oldószer hozzáadása egy koncentrációs gradiens mentén (fekete szaggatott vonalként látható) folyamatosan csökkenti a mozgó fázis (Y tengely) teljes polaritását. A vegyületek képesek ragaszkodni az oszlophoz vagy a mobil fázishoz, attól függően, hogy mennyire polárisak. A vegyületek végül ragaszkodnak a mobil fázishoz, amikor polaritásuk megegyezik a mobil fázis polaritásával. Ezután disszociálnak az oszloptól, és egy adott időpontban (X tengely) eluálódnak a futás során. Ez az idő az adott vegyület Rf-ként ismert.
A kimenet megértése
a HPLC-Futtatás kimenetét vagy eredményeit általában kromatogramnak tekintik (2.ábra). Ez egy vízszintes csúcssorozat, amely az oszlopból eluált vegyületeket képviseli, különböző Rf értékekkel. A Modern HPLC berendezéseket gyakran összekapcsolják a dióda tömb detektor (DAD), lehetővé téve a felhasználó számára, hogy az elválasztott vegyületek kapott kromatogramját 190 nm-től 900 nm-ig terjedő hullámhosszon nézze meg. Ha a vizsgált vegyületek ismertek, a felhasználó dönthet úgy, hogy csak 1 vagy néhány kiválasztott hullámhosszra néz. Például a kokain 254 nm-en figyelhető meg.
2.ábra: egy tipikus HPLC kromatogram
2. ábra: ez a kromatogram a vegyületek kémiai reakciótól való elválasztását mutatja, és a kromatogram 254 nm-en látható. Két fő csúcs fordul elő 8,20 és 9 perc alatt, ami két ilyen retenciós idővel rendelkező vegyületet jelent. Az elnyelési egységek száma (AU) az Y tengelyen, míg a futás ideje az X tengelyen látható.
Alkalmazások
a biológián és az orvostudományon belül a HPLC-t gyakran használják analitikai eszközként a biológiai és környezeti minták ismert vegyületek (például metabolitok, gyógyszerek, toxinok, peszticidek) jelenlétének vagy hiányának vizsgálatára, és segíthet az ismeretlen vegyületek azonosításában.
a kémián belül azonban a HPLC-t rutinszerűen használják a kémiai reakciók megfigyelésére, valamint a termékek tisztaságának meghatározására. Ezenkívül a HPLC folyamata preparatív HPLC-vé módosítható, amelynek során az érdekes vegyületek további felhasználás céljából tisztíthatók.
a HPLC kezdetben nagyon bonyolultnak bizonyulhat, de biztos lehet benne, hogy a legtöbb más laboratóriumi technikához hasonlóan sokkal értelmesebb, ha valóban megteszi.
Stay tuned az én nyomonkövetési cikkek az elkövetkező hetekben, amelyben megyek át néhány mutatót, hogyan lehet a legjobbat kihozni a HPLC távon függően a kutatási cél, valamint tárgyilagosan megvitatják, hogyan HPLC lehet használni a kutatás.
van-e más szempontja ennek a technikának, amelyet részletesebben szeretne lefedni? Ha igen, szeretnénk hallani rólad!
Boldog HPLC-ing!
Ez segített neked? Akkor kérjük, ossza meg a hálózattal.