A koleszterin hatása a foszfolipid kettős réteg szerkezetére

kulcsszavak:

• biomembrán
• molekuláris szimuláció
• fázis viselkedés
• dimyristoylphosphatidylcholine
• mezoszkópos modell

ebben a cikkben egy látszólag egyszerű termodinamikai kérdéssel foglalkozunk: hogyan változik a foszfolipid membrán molekulánkénti területe, ha koleszterint adunk hozzá? Ezt a kérdést először Leathes (1) tette fel 1925-ben, és ma is megvitatják. Ennek a kérdésnek a jelentősége közvetlenül kapcsolódik a koleszterin fontosságához a magasabb eukarióták membránjainak működéséhez. Például a koleszterin szabályozza a membrán folyékonyságát és modulálja a membránfehérjék működését (2). Ezeknek a mechanizmusoknak a megértése sok kutatót motivált a lipid–koleszterin kölcsönhatások részletes vizsgálatára. Mivel a membrán 2D folyadéknak tekinthető, az első becslés arról, hogy a molekulánkénti terület hogyan változik a koleszterin hozzáadásával, az ideális keverés feltételezése lenne, ahol a molekulánkénti terület egyszerűen a tiszta komponensű területek súlyozott átlaga. 1925-ben Leathes megmutatta, hogy az ideális keverés helyett feltűnő nem ideális viselkedést figyelünk meg (1). Ezt a nem ideális viselkedést kondenzációs hatásnak (3) nevezzük, mivel a molekulánkénti terület sokkal alacsonyabb az ideális keveréshez képest. Mivel a membrán összenyomhatatlan folyadékként viselkedik, a molekulánkénti terület csökkenése a kétrétegű teljes vastagságának megfelelő jelentős növekedését eredményezi. A vastagság ilyen növekedése a membrán szerkezetének átszervezését jelzi. Mivel a membrán szerkezetének változásai fontos következményekkel járhatnak a fehérjék működésére (2), fontos a koleszterin által kiváltott változások molekuláris megértése.

különböző fogalmi modelleket javasoltak a nem ideális koleszterin–lipid kölcsönhatások magyarázatára. Ilyen például a kondenzált komplexek modellje (4, 5), a szuperlattice modell (6) és az esernyő Modell (7). A kondenzált komplexek modellje azzal magyarázza a kondenzációs hatást, hogy feltételezi, hogy a koleszterin indukálja a sztöchiometrikus koleszterin–lipid komplex reverzibilis képződését. Egy ilyen komplexben a membrán kondenzálódik, mivel a lipid Acil láncok rendezettebbek. Egy adott koleszterinkoncentráció esetén egyensúlyi összetétel áll fenn a kondenzált koleszterin–lipid komplexek és a közönséges lipidek között. A szuperlattice modell feltételezi, hogy kritikus koncentrációkban a koleszterinmolekulák meghatározott hosszú távú sorrendet mutatnak. Az esernyő Modell azt a nézetet veszi figyelembe, hogy a koleszterin hidrofil része túl kicsi, ezért a lipideknek hozzá kell járulniuk a koleszterinmolekulák szűréséhez a vízzel való hidrofób kölcsönhatásokból. A foszfolipidek csak akkor hozhatják létre ezt az esernyőt, ha ezek a molekulák kiegyenesednek, hogy helyet teremtsenek a koleszterin számára. Ezekben a modellekben a kondenzációhoz vezető mögöttes mechanizmusok nagyon eltérőek. Érdekes módon egy nemrégiben készült kísérleti tanulmány arra a következtetésre jutott, hogy adataik alátámasztották a kondenzált komplexek modelljét (8), míg egy másik kísérletsorozat nem talált utalást a kondenzált komplexekre, és támogatta az esernyő modellt (9). Ezek a betekintési különbségek motiváltak minket a lipid–koleszterin–víz rendszer mezoszkópos modelljének kidolgozására. Molekuláris szimulációkat használtunk, hogy fényt derítsünk a koleszterin oldalirányú szerveződésére a lipidmembránokban és a mögöttes lipid–koleszterin kölcsönhatásokra, amelyek a kondenzációs hatást indukálják.

a szakirodalomban számos molekuláris szimulációról számoltak be a lipid kettős rétegekben lévő koleszterin teljes atom-és durva szemcsés modelljeiről (néhány közelmúltbeli példát lásd A refs-ben. 10-13.). Ideális esetben minden atom szimulációt szeretnénk használni a kondenzációs hatás tanulmányozására a hőmérsékletek és a kompozíciók széles skáláján. Jelenleg azonban ezek a szimulációk túl időigényesek. Ezért durva szemcsés modellt használunk, amelyben a hatékonyságot az összes atommodell néhány részletének integrálásával nyerjük. Modellünk Kranenburg és munkatársai (14, 15) modelljén alapul. A modell explicit vízmolekulákat használ. A lipidek és a koleszterin hidrofil és hidrofób részecskékből állnak (Lásd az ábrát. 1). Ez a modell atomcsoportokat darabol egy mezoszkópos pszeudoatomba. Az intramolekuláris kölcsönhatások magukban foglalják a kötés rezgéseit és a kötés hajlítását, amelyek paramétereit úgy optimalizálták, hogy utánozzák a vízben lévő egyetlen atomos foszfatidilkolin molekula szerkezetét. A hidrofil és hidrofób kölcsönhatásokat lágy-repulzív kölcsönhatásokkal írják le, és ezeknek a kölcsönhatásoknak a paraméterei a Groot és Rabone által leírt módszer alkalmazásával kapcsolódnak az oldhatósági paraméterekhez (16). Ennek a modellnek az az elképzelése, hogy a koleszterin–foszfolipid keveredés fő mozgatórugói a hidrofób és a hidrofil kölcsönhatások, ami számos kísérleti tanulmány következtetése (7, 9, 17). A mi modellünkben a hosszegység közvetlenül kapcsolódik a pszeudoatom tényleges méretéhez, azaz egy pszeudoatom 90 köbméter térfogatot foglal el3. Az energiaegység a mezoszkópos vízrészecskék lágy taszítási paramétereinek a víz környezeti körülmények közötti összenyomhatóságához való illesztéséből következik. A modellek egyszerűsége megköveteli a lágy taszítások újramérését, ha a hőmérséklet megváltozik. Ebben a munkában azonban feltételezzük, hogy a paraméterek függetlenek a hőmérséklettől. A hőmérsékleti skálát úgy állítjuk be, hogy a kísérleti fázisú átmeneti hőmérsékletekhez igazítjuk. A modell további részletei és alkalmazásai megtalálhatók a ref. 18.

a koleszterin modellünk, Az ábrán látható. Az 1B ugyanazokon a feltételezéseken alapul, mint a lipid modell. McMullen et al. (19), a koleszterin modell hidrofób részét kissé hosszabbá tettük, mint a lipid modell hidrofób részét, amelynek célja a dimirisztoil-foszfatidilkolin (DMPC) képviselete. Az egyszerűség kedvéért azt feltételeztük, hogy egy koleszterin molekula hidrofób és hidrofil kölcsönhatásai hasonlóak a lipidekéhez. A koleszterin kondenzációs hatásának molekuláris mechanizmusába való betekintés érdekében három koleszterinszerű molekulát vezettünk be, amelyekben megzavarjuk a molekula hidrofób–hidrofil egyensúlyát: az egyiket, amelyben csökkentjük a hidrofób farok hosszát (Lásd az ábrát. 1C), amelyben további hidrofób csoportot adunk hozzá (ábra. 1D), és az egyik, amelyben a gyűrűt egy egyszerű láncra cseréljük (ábra. 1E).

ábra. A 2. ábra a víz–foszfolipid–koleszterin rendszer számított hőmérséklet-összetétel fázisdiagramját mutatja. A fázishatárokat a pillanatfelvételek szemrevételezésével, mennyiségileg pedig a görbék inflexiós pontjaiból nyertük, amelyek megadják a lipidenkénti területet, a membrán átlagos hidrofób vastagságát, valamint a farok sorrendjét és dőlési paramétereit. Ezeket a tulajdonságokat a hőmérséklet és a koleszterin tartalom függvényében számítottuk ki.

először a tiszta lipid fázisokra összpontosítsunk, a koleszterin hatását pedig a következőkben tárgyaljuk. A tiszta lipid kettős réteg esetében a fázisdiagramot Kranenburg és Smit (14) számította ki egy négyszer kisebb rendszerre. Ugyanazt a módszert alkalmaztuk a fázishatárok meghatározására, mint Kranenburg és Smit (14). Eredményeink kiválóan egyetértenek ezzel a vizsgálattal, ami azt jelzi, hogy a véges méretű hatások kicsiek. A tiszta foszfolipid esetében magas hőmérsékleten folyékony fázist (La) figyelünk meg, amelyben a farok rendezetlen. Alacsony hőmérsékleten a farok rendezett és megdöntött, ami meghatározza a gél fázist (L ‘ C). Ezt a két fázist a hullámosított fázis (p’) választja el egymástól, amelyben megfigyeljük a domének mikrofáz elválasztását, amelyekben a kétréteg vastag és a lipidek rendezettek, valamint azokat a doméneket, amelyekben a kétréteg vékony és a lipidek rendezetlenek. E három fázis jelenléte azt jelzi, hogy a kapott fázisdiagram nagyon jó összhangban van a tiszta lipid (20) kísérleti diagramjával. A hőmérsékleti skálát úgy állítják be, hogy a gélfázis fázisátmeneteinek hőmérsékleteit a hullámfázis (Tp), a hullámfázis pedig a folyadékfázis (Tm) hőmérsékletéhez igazítják a tiszta DMPC megfelelő kísérleti fázisátmeneti hőmérsékletével. A kísérleti adatokkal további összehasonlítást végzünk a kétrétegű molekulánkénti átlagos területre vonatkozóan (ábra. 3A), a kétrétegű vastagság (ábra. 4A), valamint a lipid farok sorrendje (ábra. 4B). A lipidonkénti területre molekulánként 56 60-at kapunk, szemben a kísérleti (21) 60-mal) 2-vel. A kétrétegű vastagság esetében 38,7-es értéket számítottunk ki, ami jól összevethető a 36-os kísérleti értékkel (21), és hasonló egyezést kapunk a farokrendre vonatkozóan (lásd az ábrát. 4B). A tiszta koleszterin molekulánkénti területének kiszámításához kétrétegű tiszta koleszterint szimuláltunk. 40,3-os értéket kaptunk, ami nagyon jól hasonlít a legutóbbi 41 (22) kísérleti értékhez egy egyrétegű koleszterin esetében. A modellünkben szereplő közelítéseket figyelembe véve meglepően jó az egyetértés a kísérleti és a szimulált értékek között.

térjünk most a koleszterinnek a kétrétegű tulajdonságaira gyakorolt hatására. Az első kérdés, amellyel foglalkozunk, az, hogy modellünk képes-e reprodukálni a kondenzációs hatást. Fig. A 3a a koleszterin hatását mutatja a molekulánkénti területre a koleszterin koncentráció függvényében. A kísérleti adatokkal való összehasonlítás ismét nagyon jó egyetértést mutat. Ezen az ábrán a molekulánkénti területet is megmutatjuk, feltételezve az ideális keverést. Ez az ábra meggyőzően szemlélteti a kondenzációs hatást; a molekulánkénti terület sokkal jobban csökken, mint amire az ideális keverés alapján számítani lehetne. Egyéb kísérleti adatok közé tartozik a koleszterin hatása a kétrétegű duzzanatra (ábra. 4A) és a farok sorrend paramétere (ábra. 4B). Mind a kísérleti adatok, mind a szimuláció azt mutatják, hogy a koleszterin növeli a kétréteg vastagságát és annak sorrendjét. E két tulajdonság esetében is szimulációs eredményeink nagyon jó összhangban vannak a kísérleti adatokkal. A szimulációs és kísérleti adatok (füge. 3A és 4 A és B) azt mutatják, hogy a koleszterin hozzáadása erősen módosítja a lipid kettős réteg tulajdonságait, akár 30 mol % koleszterinig. Ezt követően egy olyan régió érhető el, ahol a koleszterin további hozzáadása csak enyhe hatást fejt ki. A 30 mol% – os koleszterinszint mellett mind a molekulánkénti terület, mind a lipid farok sorrendje és dőlés paraméterei olyan értékekkel rendelkeznek, amelyek jellemzőek a gélfázisra.

a színkódolás ábrán. A 2. ábra a lipidenkénti szimulált terület és az ideális keverés feltételezésével becsült érték közötti különbséget mutatja. Megfigyeljük, hogy magas és alacsony hőmérsékleten a kondenzációs hatás viszonylag kicsi. A kondenzációs hatás maximális a fázistér jól meghatározott régiójában, amely közvetlenül a tiszta foszfolipid fő fázisátmenete felett helyezkedik el. A kondenzációs hatás természetének jobb megértése érdekében fontos megérteni a koleszterin hozzáadásának hatását a membrán fázis viselkedésére.

ábra. A 2. ábra a fázisdiagram legfontosabb jellemzőit mutatja. A szimulációink során megfigyelt különböző fázisokat kísérletileg is megfigyelték, bár nem mindig a dmpc és a koleszterin specifikus keverékére (20, 23, 24). A különböző kísérleti tanulmányok azonban minőségileg nagyon eltérő fázisdiagramokat mutatnak, ami korlátozza a részletes összehasonlítás lehetőségét. A különböző fázisok pillanatképei az ábrán találhatók. 5.

nagyon magas hőmérsékleten az 50 mol% – os koleszterin hozzáadása kevés hatással van a membrán szerkezetére, és minden koncentrációra megfigyeljük az La fázist (24). A Tp alatti hőmérsékleten megfigyeljük, hogy a koleszterin megváltoztatja a gélfázis szerkezetét azáltal, hogy gátolja a lipid farok dőlését, ami az L ‘ C fázis kialakulását okozza (20) (hasonlítsa össze az ábrát. 5 D E-vel). Magasabb koleszterinszint esetén (>20%) megfigyeljük a kis, koleszterinben gazdag klaszterek kialakulását. Ezt a fázist LII-vel jelöljük, ezt a fázist pedig az ábra mutatja. 5E. a TP és a Tm közötti hőmérsékleten a tiszta kétréteg a hullámzási fázisban van, és a koleszterin átalakítja ezt a hullámzási fázist (Lásd az ábrát. 5c) folyadékrendezett fázisba (23) (ábra. 5B). A folyadékrendelt fázis kifejezést Ipsen et al. (25). A kétrétegű réteg vastagsága köztes a folyadék vastagsága és a gélfázis között. A lipid tail-order paramétereknek olyan értékei vannak, amelyek közel állnak a gélfázishoz; azonban a gélfázissal ellentétben a lipidek rendezetlenebbek és nem dőlnek meg. A koleszterin fokozatosan növeli azt a hőmérsékletet, amelyen az La-lo fázis átmenet bekövetkezik. Nagyon magas koleszterinszint esetén a folyadék rendezett fázis gélfázissá (LII) alakul át, amikor a hőmérséklet Tm alá csökken. Ezt a fázist kísérletileg megfigyelték a dipalmitoil-foszfatidilkolin (26) esetében, de nem találtunk kísérleti adatokat a DMPC-ről ilyen körülmények között. Most térjünk vissza a kondenzációs hatáshoz. Fig. A 2. ábra azt mutatja, hogy a kondenzációs hatás maximális a TM fő átmenet feletti hőmérsékleten. Ennek oka az, hogy ilyen körülmények között a tiszta kétrétegű folyadék-rendezetlen állapotban van, míg a koleszterin hozzáadása a kétréteghez folyadék-rendezett fázissá alakítja, amelynek lipidenkénti területe sokkal kisebb a folyadék-rendezetlen állapothoz képest. Ez a nagy különbség nagy kondenzációs hatást okoz. Magasabb hőmérsékleten a folyadékfázis minden koleszterin-koncentrációban stabil marad, ami sokkal kisebb kondenzációs hatást eredményez. Alacsonyabb hőmérsékleten a tiszta lipid kettős réteg lipidenkénti területe sokkal közelebb van a folyadék rendezett fázis lipidenkénti területéhez, ennek eredményeként a kondenzációs hatás sokkal kisebb.

a fenti eredmények azt mutatják, hogy a kondenzációs hatás közvetlen következménye a fázis viselkedésében bekövetkező bizonyos változásoknak, amelyeket a koleszterin indukál. Az irodalomban különféle spekulációk vannak a koleszterinszerkezet azon aspektusairól, amelyek kifejezetten felelősek a kondenzációs hatásáért. Például az esernyő Modell azon az elképzelésen alapul, hogy a foszfolipidekkel összehasonlítva a koleszterin hidrofil része sokkal kisebb, ezért a foszfolipidnek esernyőként szüksége van a vízzel való kölcsönhatások további szűrésére. Ez arra utal, hogy egy további hidrofil csoport teljesen megváltoztatná a tulajdonságokat. Egy másik fontos tényező a terjedelmes gyűrűszerkezet; ha a gyűrűt farokkal helyettesítjük, olyan molekulát kapunk, amely jobban hasonlít egy alkoholmolekulára (27). A hidrofób farok rövidítésének azonban kevés hatása lenne. Fig. Az 1. ábra a módosított koleszterinmolekulákat mutatja, amelyek utánozzák ezeket a változásokat. Valóban, az eredmények ábra. A 3B azt mutatja, hogy a koleszterin farkának lerövidítése ugyanazt a kondenzációs hatást mutatja. Azonban, Ábra. A 3B azt mutatja, hogy a koleszterinmolekula mind a többi módosításakor, egy további hidrofil csoport hozzáadásával, mind a gyűrű lineáris lánccal történő helyettesítésével nem figyelhető meg kondenzációs hatás. Megfigyeljük az ellenkező hatást: ezeknek a molekuláknak a hozzáadásával a kétréteg kibővül az ideális keveréshez képest. Kísérletileg mértük a (kisebb) alkoholok hatását az egy molekulára jutó területre, és a kísérleti adatok is növekedést mutatnak (28). Ehhez szorosan kapcsolódva megfigyeltük, hogy a fázisdiagramon mindkét esetben a folyadékfázis stabil volt a teljes koncentrációtartományban. Valójában megfigyeljük, hogy ezeknek a molekuláknak a hozzáadása csökkenti a fő átmeneti hőmérsékletet, ezért a fázisdiagramban nincs olyan régió, ahol nagy kondenzációs hatás lenne.

a koleszterin ezen szerkezeti variációival végzett szimulációk azt mutatják, hogy meglepően finom a mechanizmus. A tiszta kétrétegű fő átmenet nagyon érzékeny a hidrofób kölcsönhatásokra. A lipidek fejcsoportjai kiszűrik a hidrofób farkakat a vízből. Magas hőmérsékleten a lipidenkénti terület magas, és ez a szűrés messze nem optimális; de ilyen körülmények között a lánc entrópia dominál. A hőmérséklet csökkentése egyre fontosabbá teszi a hidrofób kölcsönhatások szűrését, és a fő átmenetnél végül a láncok sorrendjét idézi elő. Kulcsfontosságú szempont annak megértése, hogy a koleszterin hogyan destabilizálja a folyadékfázist. A koleszterinnek kisebb hidrofil feje van, ezért kevésbé hatékony a hidrofób kölcsönhatások árnyékolásában. Magas hőmérsékleten a lipid kettős réteg képes ezt befogadni, de alacsonyabb hőmérsékleten a lipidek csak akkor járulhatnak hozzá a koleszterin szűréséhez, ha csökkentik annak lipidenkénti területét. Ez okozza a megfigyelt sorrendet, és megmagyarázza, miért növekszik a fő átmenet. A koleszterin szerkezetében bevezetett két változás befolyásolja annak hidrofób szűrését; mindkét változatban eltűnik a koleszterin belső árnyékolása. Ha ezeket a molekulákat hozzáadjuk a kétréteghez, nincs szükség a hidrofób kölcsönhatások további szűrésére, és ezek a molekulák megakadályozzák a rendezett fázis kialakulását.

hasonlítsuk össze megfigyeléseinket a korábbi modellekkel, amelyeket a kondenzációs hatás magyarázatára vezettek be. Először is, modellünk nem utal a hosszú távú megrendelésre, amint azt a superlattice modell feltételezi. Mind az esernyő modellben, mind a kondenzált komplexekben Implicit valamilyen helyi szervezet feltételezése. Például az esernyő modellben feltételezzük, hogy egy lipid molekula egy vagy két szomszédos koleszterinmolekulát szűrhet (lásd pl. 2). Szimulációink egy sokkal rendezetlenebb struktúrát mutatnak, amelyben nem tudjuk azonosítani ezeket a rendezett struktúrákat. Ezen a ponton fontos emlékeztetni arra, hogy modellünk számos feltételezést tartalmaz, ami felveti a kérdést, hogy a szimulációinkból levont következtetések relevánsak-e a kísérleti rendszerek szempontjából. Nagyon meglepődtünk, amikor láttuk, hogy ilyen gazdag fázisú viselkedést tudtunk elérni egy durva szemcsés modell alkalmazásával, amely tisztán visszataszító erőket használ. Modellünk nagyon ésszerű mennyiségi leírást ad a kétrétegű szerkezet legújabb kísérleti adatairól. A másik érdekes szempont, hogy számításaink azt jósolják, hogy a kondenzációs hatás a fő átmenet feletti szűk hőmérsékleti tartományban maximális. Lehet, hogy ezt kísérletileg ellenőrizni lehet. Modellünk nagyon szigorú tesztje részletes összehasonlítás lett volna a kísérleti fázis diagrammal. Ebben az összefüggésben biztató, hogy az általunk talált fázisokat kísérletileg figyelték meg, bár nem mindig pontosan a szimulált rendszer esetében. Ha gondosan kiválasztjuk azokat a kísérleti adatokat, amelyek megegyeznek a szimulációinkkal, akkor még nagyon jó megállapodást is igényelhetünk. A különböző kísérletek közötti nézeteltérés egyik lehetséges oka az, hogy különböző technikákat alkalmaznak, és nem minden technika egyformán érzékeny a különböző fázisok szerkezetének különbségeire. Reméljük, hogy a fázisdiagram és a különböző fázisok szerkezetére vonatkozó részletes információk kombinációja iránymutatást ad arra vonatkozóan, hogy egy adott kísérleti technika képes-e azonosítani egy adott fázisátmenetet.