minden módszert a vonatkozó irányelvekkel és előírásokkal összhangban végeztek. Minden alanytól tájékozott beleegyezést kaptak.
anyag
a következő ezüst kötszereket hasonlítottuk össze: Acticoat (Smith&unokaöccse, Egyesült Királyság; ebben a cikkben Ac-ként említik), Aquacel Ag + Extra (Convatec, Egyesült Királyság; ebben a cikkben Aq-ként említik), Silvercel hidro-alginát (Systagenix, Egyesült Királyság; e cikkben Sc) és Ialugen Plus (IBI, Cseh Köztársaság; e cikkben Ia).
egyéb vegyi anyagokat a Sigma–Aldrich-től (St. Louis, USA) kaptunk, ha másként nem jeleztük.
kivonatok készítése
több vizsgálatban a kötszerek kivonatait használták, nem pedig magukat a kötszereket. Ezeket a kivonatokat fiziológiás sóoldat (0,9% (w/v) NaCl) vagy sejttenyészet alkalmazásával állítottuk elő táptalaj kiegészítve 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS). Az öltözködési terület aránya az oldathoz 1 cm2 / 4 mL oldat volt. Az extrakciót 72 órán keresztül végeztük RT-n állandó keverés mellett. Az extraktumokat sterilizáljuk, 0,2 CBC szűrőn keresztül vezetjük át, és 4cbc-n tároljuk a felhasználásig.
Ezüstkoncentráció mérése
a kötszerekben és a kötszerkivonatokban lévő ezüstkoncentrációkat ICP-OES alkalmazásával mértük. Az ezüstkoncentrációt sertés ex vivo bőrmintáiban is értékelték. Minden mintából 10-70 mg-ot vittünk át egy PTFE edénybe mikrohullámú emésztés céljából. Ezután 1 mL tömény salétromsav (nyomelemzési fokozat, Analytika Kft., Cseh Köztársaság), 0.8 mL tömény sósav (nyomelemzési fokozat, Analytika Kft., Cseh Köztársaság) és 0,2 mL hidrogén-peroxidot (p.a. 30%, Penta Ltd., Cseh Köztársaság) kerültek hozzáadásra. A mintát 150 C-on emésztettük 5 percig, majd ugyanazon ciklus második lépésében 200 C-on 10 percig. Az emésztést követően a mintát 0,2 mL hidrogén-peroxid és ionmentesített víz felhasználásával mennyiségileg átvittük.
az elemzést egy ICP-OES műszerrel (Radial 725, Agilent Technologies, Ausztrália) végeztük, amely pneumatikus tengeri porlasztóval és ciklonikus permetező kamrával volt felszerelve. A számszerűsítés külső kalibráción alapult. A módszer pontosságát és megbízhatóságát igazolt referenciaoldatból (Analytika Ltd.) származó, ismert Ag koncentrációjú sertésbőrminták felhasználásával vizsgálták., Cseh Köztársaság).
pásztázó elektronmikroszkópia
pásztázó elektronmikroszkópos (sem) elemzéseket végeztünk egy Zeiss Ultra Plus műszerrel (Zeiss, Németország). A mintákat vékony AU/Pd réteggel vontuk be egy Quorum SC7620 porlasztó bevonatban. A képeket két másodlagos InLens és SE2 elektrondetektor készítette nagyobb vagy kisebb nagyítás céljából. A szkennelési paraméterek a következők voltak: gyorsító feszültség, 3,5 kV; szondaáram, 36 pA; és nyomás a kamrában, ~ 7 ^ 10-5 Pa.
EDX képeket a Zeiss Ultra Plus műszerrel készítettünk. A röntgen térképeket és spektrumokat egy X-MaxN 80 Röntgendetektor (Oxford Instruments, Egyesült Királyság) készítette. Az EDX paraméterei a következők voltak: gyorsító feszültség, 10 kV; szonda áram, 300 pA; munkatávolság, 8,5 mm; folyamatidő, 4 .
kötszerek közvetlen oxidatív aktivitása
A Ros képződését sejtmentes körülmények között 3,3′,5,5′-tetrametil-benzidin (TMB) alkalmazásával értékeltük a torma peroxidáz (HRP) szubsztrátjaként. A kötszerekből 6 mm átmérőjű köröket vágtunk ki és teszteltünk. Röviden, a munkaoldat 0,1 mg/mL TMB–ből (törzsoldat C = 1 mg/mL DMSO-ban) állt, 1:9 arányban keverve 0,05 M citrát-foszfát pufferrel (pH = 5) és HRP-vel (végső c = 0,16 NE/mL). A kötszer minden darabját 0,5 mL munkaoldatba merítettük, és 0, 5, 7,5 és 10 perc elteltével mintákat (25) vettünk. Közvetlenül a gyűjtés után a mintákat 1:1 arányban 0,16 M H2SO4 arányban keverték össze, majd az abszorbanciát 450 nm-en (referencia hullámhossz = 540 nm) leolvasták egy NanoDrop OneC műszerrel (ThermoFisher Scientific, USA). 30% H2O2-t használtak pozitív kontrollként. A háttérjelet (üres megoldás) kivonjuk.
ezüst penetráció a hámtalanított bőrbe
statikus diffúziós Franz sejteket használtunk az ezüst penetrációjának vizsgálatára a hámtalanított bőrbe. A bőrt egy helyi vágóhídról (Bocus, Letohrad, Cseh Köztársaság) nyerték ki, és a sertés auricle belső részéből kivágták. A hajat leborotválták, a bőrt PBS-ben inkubálták (60 C, 90 s), és az epidermist lehámozták. Az epithelizált bőr átlagos vastagsága 2 mm volt.a bőrdarabokat egy kamrába helyezték, és egy tesztelt ezüst kötéssel vagy egy darab gézzel borították. Minden donorkamrát 0,3 mL NHDF táptalajjal töltöttünk meg 10% FBS-sel. Az akceptor kamra 0,7 mL táptalajt tartalmazott. A diffúziós sejteket inkubáltuk 37 CC-n 24 vagy 48 órán keresztül. Inkubálás után a bőrt PBS-sel öblítettük, és a donor-és akceptorkamrákat elválasztó bőrrészeket ICP-OES-sel elemeztük az ezüsttartalom szempontjából, a fent leírtak szerint. Az epithelizált bőrön áthatoló ezüst mennyiségét a donor folyadékban mértük. Mindkét alkalommal három független ismétlést készítettek.
ex vivo bőr ápolása kötszerekkel
friss (1-2 óra) sertésbőrt (Bocus) alaposan megtisztítottunk szappannal és betadinnal (PVP jódoldat, Egis Pharma, Magyarország), majd vízzel leöblítettük. Az aurikulákból származó bőrdarabokat (1 db 1 cm) kivágtuk és antibiotikum oldatba (penicillin–sztreptomicin oldat, 10 000 egység/mL penicillin, 10 mg/mL sztreptomicin) helyeztük 30 percig 37 köbméter C hőmérsékleten légköri O2 és CO2 alatt. Az ép epidermiszű bőrmintákat bőrfelülettel felfelé, 6-kút művelőlemezekbe helyeztük, 3 mL NHDF táptalajjal, 10% FBS-sel kiegészítve, majd 1 USD 1 cm kiválasztott ezüsttartalmú öntettel vagy steril kontroll gézzel letakarva, 300 ppl művelőközeggel átitatva. A mintákat 24 vagy 48 órán át inkubáltuk. Ezt követően a bőrt PBS − sel leöblítettük, és minden egyes bőrrobbanást harmadokra osztottunk szövettani vizsgálat céljából (4% – os PFA-fixálás 4 GB C-nál), Western blot (folyékony nitrogénnel történő snap-fagyasztás) és qPCR (egy éjszakán át rnalaterben (Thermo Fisher Scientific), majd-80 C-nél).
szövettani festés
Az ezüst autometallográfiai festését Danscher et al.49. A képeket egy Eclipse 50I mikroszkóp segítségével rögzítették egy mellékelt DS-Fi1 kamerával (Nikon, Yokohama-Shi, Japán).
az yh2ax immunfluoreszcenciájához a Superfrost Plus üveglemezek (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) szövettani szakaszait depaffinizálták és egy éjszakán át inkubálták primer antitesttel (1:1000, ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, JBW301 klón, Millipore, MA, USA). Ezután 1 órán át inkubáltuk őket egy másodlagos antitesttel (ab150114, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság; hígítás 1:10 000), majd dapi-val (ThermoFisher Scientific) ProLong Diamond Antifade szerelővel ellátott tárgylemezekre szereltük. A képeket Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japán) fluoreszkáló mikroszkóppal készítették.
génexpresszió
sertésbőrt kötszerekkel történő inkubálás után RNS izoláció, cDNS szintézis és qPCR génexpresszió céljából dolgoztunk fel, amint azt Klein et al.50 a qPCR-hez használt TaqMan valós idejű PCR-vizsgálatok (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a következők voltak: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. A küszöbciklus értékeit az RPL13A háztartási génre normalizáltuk, és az adott időre (24 – vagy 48-órás intervallum) a géz kontrollmintákhoz kapcsolódott a 2-Act-módszer alkalmazásával 51. Minden kezelésre és időre hat független mintát mértek és átlagoltak. A génexpresszió különbségeinek jelentőségét a gézkontrollhoz viszonyítva a Student t-tesztjével értékeltük minden ezüst kötszerre a megadott idő alatt.
Western blot
a későbbi Western blot analízishez szöveti lizátumokat állítottunk elő fagyasztott sertésbőrből. Szikével egy csepp lízispufferben (50 mM tris pH 8; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% nátrium-dezoxikolát; 1% nátrium-dodecil-szulfát; 4% karbamidot), a bőrt apró darabokra vágtuk, amelyeket ezt követően a lízispuffer 350cl-ben homogenizáltunk egy rozsdamentes acél 5 mm-es gyöngy és egy szövet homogenizátor (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Németország) segítségével 10 percig 25 Hz-en. A fehérje koncentrációját a BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific) segítségével mértük.
a Lizátumokban lévő fehérjéket 4-15%-os gradiens SDS-PAGE segítségével szétválasztottuk, és a polivinilidén-difluorid membránokra továbbítottuk. Specifikus fehérjék kimutatására a membránokat egy éjszakán át inkubáltuk egy blokkoló pufferben (20 mM Tris; 137 mM NaCl; 0,05% Tween 20; 5% szárított alacsony zsírtartalmú tejpor) az elsődleges antitesttel foszfo-hiszton H2A. X (20e3) (1:1000; sejtjelzés, USA). a fehérjemennyiség-terhelési kontrollként (1:2000; Santa Cruz, USA) az aktint használták. A membránokat HRP-konjugált nyúlellenes vagy egérellenes Ig-vel fejlesztették ki kemilumineszcens detektálással a jelek megjelenítésére (Clarity Western ECL szubsztrát; Bio-Rad, USA). A jeleket egy Alliance 9.7 Chroma Chemiluminescence képalkotó rendszerrel (UVItec Limited, Egyesült Királyság) vizsgálták és értékelték.
antibakteriális aktivitás
az agar diffúziós módszert alkalmazták a kötszerek antimikrobiális aktivitásának összehasonlítására. Mindegyik kötszerből egy mintadarabot (1 cm2) inkubáltunk egy frissen beoltott Petri-csészében Staphylococcus aureus vagy Pseudomonas aeruginosa-val; ezeket a törzseket humán krónikus sebekből izoláltuk, jellemeztük és tenyésztettük az előzőek szerint52. Ezenkívül a kötszerkivonatok antimikrobiális hatásosságát (rpmi közegben, 10% FBS-sel készítve, a fent leírtak szerint) összehasonlítottuk a mikrodilúciós módszer53 alkalmazásával. Az optikai sűrűséget egy Ensight multimódusú lemezolvasóval (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) mértük 600 nm-en 24 órán keresztül (remegés, 37 C).
sejttenyészet
a felnőtt bőrből származó normál humán dermális fibroblasztokat (NHDF) Lonzából (Bázel, Svájc) vásárolták. Az NHDF-et a Dulbecco módosított Eagles alacsony glükóztartalmú táptalajában (DMEM) termesztették, kiegészítve 10% FBS-sel, glutaminnal (0,3 mg/mL), glükózzal (4 mg/mL), penicillinnel (100 egység/mL) és sztreptomicinnel (0,1 mg/mL) 75 cm2-es tenyésztőlombikokban, 5% CO2 alatt és 37-nél. A HaCaT keratinocytákat a H) – ból (K) vásárolták meg a HC-Tőllzel Diagnostika (K), Németország), és ugyanúgy tenyésztették, de glükóz hozzáadása nélkül a táptalajhoz.
életképesség mérése
kútonként ötezer sejtet vetettünk be egy 96 kútból álló lemezbe, 200 ppl táptalajjal, 10% FBS-sel inkubátorban (37 CC, 5% CO2) egy éjszakán át. A következő napon a sejteket a kötszerekből származó kivonatok hígítási sorozatából 200 cl-vel kezeltük (100%, 50%, 20%, vagy 10% az eredeti kivonat hígított táptalaj kiegészítve 10% FBS) a 24, 48, és 72 h. A kontroll sejteket standard 10% – os FBS táptalajjal kezeltük. Az életképességet a korábban leírtak szerint mértük54 a 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-Il)-2,5-difenil-tetrazolium-bromid (MTT) vizsgálat segítségével. Minden egyes kútban MTT törzsoldatot (20 Kb; c = 5 mg / mL) adtunk a sejttenyésztő táptalajhoz. A lemezeket 2,5 órán át inkubáltuk 37 CBC-n, majd az MTT-oldatot eltávolítottuk, 220 KB-os lízisoldatot (1:1 Propán-2-ol DMSO-val, 10% (m/v) Triton X-100-at és 0,37% (m/v) HCl-t) adtunk hozzá, és a lízist 30 percen át szobahőmérsékleten, rotációs rázógépen (150 rpm) végeztük. Az abszorbanciát 570 és 690 nm-en olvasták egy EnSight multimódusú lemezolvasóval (PerkinElmer, USA). Az adatokat Kaleidóban (PerkinElmer, USA) dolgozták fel. A végső abszorbanciát a = A570 – A690-ként számítottuk ki. A kezelt sejtek életképességének a kontrollsejtekhez viszonyított változását a következőképpen számítottuk ki: változás = (minta/kontroll – 1) 100.
közvetlen kontaktusgátlási vizsgálat
a sejteket kútonként 300 000 sejtsűrűséggel vetettük be egy 6 kútból álló lemezbe, és inkubáltuk a táptalajban, kiegészítve 10% FBS-sel 37 C-os és 5% – os CO2 alatti koncentrációval, amíg az összefolyást el nem értük. A kötszereket 1 cm2-es négyzetekre vágtuk, a sejtrétegre helyeztük, és a standard táptalajjal inkubáltuk 6 órán át. a kontroll sejteket csak a táptalajjal kezeltük. Ezt követően a sejteket PBS-sel mossuk és 4% paraformaldehiddel rögzítjük 15 percig. A sejteket 0,1% (m/v) kristály ibolya oldattal festettük (10% etanolban oldva) egy órán át, majd vízzel leöblítettük. A gátlási zónákat Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f digitális fényképezőgép (Canon) segítségével fényképeztük.
sejtek fluoreszcens festése
a DNS-károsodás elemzéséhez az NHDF sejteket mikroszkopikus tárgylemezeken vetettük be egy 6-lyukú lemezbe, 2 105-ös sűrűséggel, és hagyjuk, hogy egy éjszakán át tapadjanak. A következő napon, a sejteket kezeltük 5 .. hígított kötszer kivonatok és inkubáltuk 24 órán át. ezt követően, a sejteket rögzítettük 4% PFA alkalmazásával 15 percig. A permeabilizációt és a blokkolást követően a tárgylemezeket anti-yH2AX nyúl primer antitesttel inkubáltuk (sejtjelzés, US; 1:500 hígítás blokkoló pufferben—20% FBS, 0,3 M glicin, 0,05% Tween 20 PBS-ben; egy éjszakán át; 4 CBC). A detektálást Alexa Fluor 555-Tel jelölt másodlagos antitest alkalmazásával végeztük (Abcam, Egyesült Királyság; 1:500 blokkoló pufferben; 1 óra, RT). A csúszdákat ProLong Diamond Antifade szerelővel szerelték fel DAPI (Thermofisher Scientific). A diák szárítása után a képeket Eclipse Ti fluoreszcens mikroszkóp segítségével készítették (Nikon, Yokohama-Shi, Japán).
intracelluláris oxidatív stresszt detektáltunk egy DCF-DA szondával, amely érzékeny a sejteken belüli teljes ROS-koncentrációra. A sejteket egy éjszakán át egy 24-lyukú lemezbe vetettük, majd 15 percig DCF-DA-Val (1 ^ g/mL) jelöltük, majd ezt követően 5 ++ hígított kötéskivonattal kezeltük őket, és 37 C-os, 5% alatti CO2-os hőmérsékleten inkubáltuk őket. Pozitív kontrollként 5 mM H2O2-t használtunk. A DCF zöld fluoreszcenciáját 15 percenként rögzítették egy 90 perces inkubációs periódus alatt Incucyte S3 automatizált mikroszkóppal (Essen Bioscience, USA). Az intracelluláris fluoreszcencia számszerűsítését Fidzsi-szigeteki szoftverben végeztük, az által leírt módszert követve, amelyet az Actinepa55 ismertetett.
a neutrofilek által okozott oxidatív burst meghatározása a teljes vérben
egy független etikai bizottság jóváhagyta a neutrofil oxidatív burst assay és a Mat vérmintagyűjtését (a Masaryk Egyetem Etikai Bizottsága, Brno, Csehország, jóváhagyás száma. EKV-2018-083). Minden adományozó írásbeli hozzájárulását adta.
a vér fagociták oxidatív burst-jét (ROS-termelését) hígított teljes vérben luminol-fokozott kemilumineszcenciával (CL) határoztuk meg LM-01T mikrolemez luminométerrel (Immunotech, Cseh Köztársaság). Röviden, a reakcióelegy 6 db teljes vérből állt 54 db rpmi-1640 táptalajban, 60 db 60 ml kötszerkivonattal keverve fiziológiás sóoldatban vagy FBS-vel kiegészített táptalajban. Ezt az elegyet 37 CC-n inkubáltuk 20 percig. Közvetlenül a mérés megkezdése előtt 1 mM-es luminolt (10 mM-es luminol törzsoldat 0,2 M-es borát pufferben) adtunk hozzá (Molecular Probes, USA). Meghatároztuk a spontán ros termelést, valamint az opszonizált zimozán részecskék (OZP—0,1 mg/mL) (Sigma-Aldrich, USA) vagy phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA—0,8) által kiváltott ros termelést; Sigma-Aldrich, USA). A vizsgált kivonatok nélküli kezeletlen mintákat kontrollként értékeltük. A vizsgálatokat másolatokban futtatták. A kemilumineszcenciát 90 percen keresztül folyamatosan regisztrálták 37 cc-nál, és relatív fényegységekben (RLU) fejezték ki. Meghatároztuk a Ros termelés teljes mennyiségét a kemilumineszcencia görbe alatti integrált területről.
monocyta aktivációs teszt (MAT)
A MAT-ot 10 ezer főnyi, sóoldattal hígított heparinizált humán teljes véren végezték. A vérmintákat öt egészséges donortól gyűjtötték össze, majd sóoldattal hígították. A hígított vérmintákat 6 mm átmérőjű körökkel inkubáltuk, amelyeket steril mikrotubokban kötszerekből vágtak ki 24 órán át 37 C. C. párhuzamosan lipopoliszacharid (LPS, végső c = 0. 25 NE / mL; Endotoxin Standard E-Toxát; Sigma, USA) adtunk a kötszermintákkal inkubált minták második sorozatához, hogy stimuláljuk a baktériumokra adott veleszületett immunválaszt. A vérsejtek az inkubáció során ülepedtek, így a sóoldattal hígított plazma felső fázisa maradt. Az inkubálást követően minden sóoldattal hígított plazmamintából 200-at gyűjtöttünk, és azonnal lemásoltuk az IL-6-ot egy IL-6 humán bevonat nélküli Elisa-készlet segítségével a gyártó protokollja szerint (ThermoFisher Scientific, USA). Az abszorbanciát egy EnSight multimódusú lemezolvasóval (PerkinElmer, USA) olvastuk, és a végső IL-6 koncentrációt a Kaleido SW (Perkin Elmer, USA) számította ki. A fennmaradó plazmát és az ülepített sejteket a hemolízis és a toxicitás értékelése céljából 4 CC-n tárolták.
hemolízis
hemolízist mutattak ki a mat maradék sóoldattal hígított plazmájában és ülepített sejtjeiben. Centrifugálás után minden egyes mintából 100 db-ot vittünk át egy 96-lyukú mikrolemezre, és az abszorbanciát 550 nm-en mértük. 1% Triton X-100-at használtunk pozitív kontrollként.
LDH felszabadulás
az ezüst kötszerek vérsejtekre gyakorolt toxicitását laktát-dehidrogenáz (LDH) vizsgálattal (Cytotoxicity Detection KitPLUS, Roche, Svájc) értékelték a gyártó utasításai szerint. Két vérsejtforrást használtunk—az emberi teljes vért ezüst kötéssel inkubáltuk, mint a MAT-ban, és izolált neutrofileket. A háttérkorrekcióhoz használt abszorbanciát üres mintákban, LDH reagens nélkül mértük. Az eredményeket az optikai sűrűség abszolút értékeként jelentik a kezeletlen mintához képest.
statisztikai elemzés
Ha másként nem jelezzük, a Student t-tesztet használtuk a minták és a kezeletlen kontrollok közötti különbségek statisztikai szignifikanciájának értékelésére.