Bordetella pertussis azonosítása kritikus állapotban lévő humán immundeficiencia vírussal fertőzött betegben a Gram-festett anyag közvetlen genotípusos elemzésével és a B-től való megkülönböztetéssel. holmesii egy egyedi recA gén restrikciós enzim hely alkalmazásával

a baktériumok klinikai mintákból történő azonosítása nagyrészt fenotípusos jellemzéssel történik in vitro tenyésztés és mikroszkópia után. Nem ritka azonban, hogy a közvetlen Gram-festett készítmények sok organizmust tárnak fel, a kultúrák azonban nem mutatják ki a kórokozót. Ezt egy közelmúltbeli klinikai eset szemlélteti, amelyben egy 48 éves AIDS-es Férfit tüdő kokcidioidomikózissal fogadtak el. A gombaellenes terápia ellenére állapota nem javult. A köpetminták sok gram-negatív bacillust tártak fel közvetlen mikroszkóppal, de a tenyészeten nem voltak kórokozók. Ezenkívül számos vérkultúra igényes gram-negatív rudakat növesztett, amelyeket hagyományos módszerekkel nem lehetett specifikálni.

úgy döntöttünk, hogy megkíséreljük a két izolátum genotípusos módszerekkel történő azonosítását univerzális oligonukleotid primerek a kis alegység rRNS (16S rRNS) gén. A légzőszervi mintákból azonban csak Gram-festett diák álltak rendelkezésre. Ezért kifejlesztettünk egy új módszert, amelyben a bakteriális DNS-t közvetlenül a Gram-festett diából nyerjük vissza. A diákat hagyományos módszerrel Gram festették (12). Egy tiszta üveglemezt mintákkal kentek, és abszolút metanollal kezelték (Mallinckrodt, Hazelwood, Mo.), majd hőrögzítés 65 cc-nál és kezelés kristály ibolya oldattal (Remel, Lenexa, Kans.). A diát tovább kezeltük Gram-jóddal (Remel), alkohol-aceton oldattal (3:1) színtelenítettük, és szafraninnal (Remel) ellenfestettük. A merülő olajat először 100% xilollal (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) távolították el a tárgylemezről, majd 100% – os etanolban öblítették. Ezután az anyagot egy egyenes borotvapengével selejtezték, 50-ben szuszpendálva oxigén-DNS hidratációs oldat (Gentra, Minneapolis, Minn.), vortexelt, és forraljuk 10 percig. A vér izolátumának elemzéséhez mind a BACTEC palackból, mind a szilárd táptalajon termesztett kolóniákból származó anyagot használtunk. Az ezt követő PCR-t 50 db-os térfogatban végeztük, amely 5 db sablont tartalmazott, 1,5 mM-es MgCl2, 100 db / dezoxinukleozid-trifoszfátot (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind.), 1 U Taq DNS-polimeráz (Roche Diagnostics Corporation), és 0,15 (egyenként) 16S univerzális rRNS primerek 11E (5′-GAGGAAGGTGGGGGATGACG-3′) és 13B (5′-TCCCGGGCCCTTGCATAAGTG-3′) a korábban leírtak szerint (15). 5 perces denaturálási lépés után 94 C-nél a PCR-lépéseket 94 C-re 60 s-ra, 50 C-re 60 s-Ra, 72 C-re 90 s-ra 30-szor megismételtük egy Perkin-Elmer GeneAmp PCR-rendszerben 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia.). A termékeket mind a köpetből, mind a vérből nyertük (ábra. 1). Ezeket a qiaquick PCR tisztító készlettel (Qiagen Inc., Valencia, Kalifornia.DNS szekvenálást végeztek egy alkalmazott Biosystems ABI3100 szekvenszeren (HHMI biopolimer/W. M. Keck Alapítvány biotechnológiai erőforrás laboratórium, Yale Egyetem Orvostudományi Kar). Későbbi összehasonlítás a nyilvános adatbázissal (GenBank) BLAST (1) azonosította a vér izolátumát Helicobacter cinaedi vagy Helicobacter rappini. Mindkét organizmust összefüggésbe hozták baktériumokkal immunhiányos betegeknél (9, 10, 13, 16, 17). A légzőszervi izolátum PCR terméke megfelelt mind a Bordetella pertussis, mind a Bordetella holmesii 16S rRNS génjeinek, amelyek 99,5% – ban homológ és azonosak az amplifikált régióban (18).

a Bordetella légzőszervi izolátum specifikálása és a genotípusos elemzés eredményének validálása érdekében egy diszkriminatív vizsgálatot fejlesztettek ki, amelyben a recA gén egy részét (6, 7) célozták meg, amely egy egyedi restrikciós enzimhelyet tartalmaz. A B. pertussis erősítése (ATCC 9340; American Type Culture Collection, Manassas, Va.) és a B. holmesii (ATCC 51541) DNS-t, valamint a páciensünk köpetgram-festését a fent leírtak szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy 3 mM MgCl2 és újonnan tervezett specifikus primerek (forward, 5′ – CAATACGCCTCCAAGCTGGG-3′; és fordított, 5 ‘- TGATGTCGAACTCGGCCTGC-3’), és a PCR lépéseket (94 C a 30 s, 59 C a 30 s, és 72 C a 60 s) 45 alkalommal megismételtük, majd egy utolsó megnyúlási lépést 72 C. A termékeket a gyártó ajánlásai szerint emésztettük ncii-vel (New England Biolabs, Inc. Beverly, Mass.). A két élőlény könnyen megkülönböztethető, mivel a B. holmesii-nak két ncii helye van, míg a B. pertussis és az összes többi Bordetella spp. csak egy ncii hely van az erősített régióban. A köpet izolátumot később B. pertussisként azonosították (ábra. 2), és humán immundeficiencia vírussal fertőzött betegeknél opportunista tüdő kórokozóként jelentették (4, 5).

ezután azt vizsgáltuk, hogy az organizmusok genotípusos azonosítása közvetlenül a klinikai Gram-festékkészítményekből univerzális primerekkel megvalósítható és reprodukálható módszer-e. A rögzítés típusa (hő, 100% metanol és 100% etanol) és a festékmaradványok jelenléte a fent leírt Gram-festés után nem befolyásolja a PCR-t. A köpet kimutatási határértéke 1500 CFU/CBL volt (6-30 organizmus olajmerülési mezőnként), ami hasonló a többi jelentéshez (14). Ehhez a megállapításhoz három véletlenszerű klinikai köpetmintát gyűjtöttek össze, amelyekben nem voltak baktériumok Gram-folton vagy tenyészetben, meghatározott mennyiségű Escherichia coli-val (ATCC 25922), rögzített és Gram-festéssel, és lekaparták a tárgylemezről a fent leírtak szerint. Számos véletlenszerűen kiválasztott klinikai mintát vizsgáltak, és amikor egy domináns organizmus mikroszkóppal látható volt, azonosítása megegyezett a tenyésztett kórokozóval (1.táblázat).

módszerünknek számos előnye van a korábban leírt vizsgálatokkal szemben. Ellentétben a korábbi jelentésekkel, amelyekben a DNS-t először kivonják a köpetből, és fajspecifikus primereket használnak (2, 11, 14, 19, 20), a Vizsgálatunk a közvetlenül Gram-festett tárgylemezekből kinyert DNS-t használja extrakciós lépések nélkül, és univerzális alapozókat használ, így lehetővé teszi a baktériumok széles körének azonosítását egy egyszerű protokoll segítségével. Mint látható, ez normál háttér-rezidens flóra jelenlétében is elérhető, mivel a PCR-ciklusok száma korlátozott, ezáltal lehetővé téve a bakteriális DNS versenyképes amplifikációját. Mivel a beadott minta minősége és a morfológiailag különböző mikrobák relatív aránya Gram-foltokon könnyen meghatározható, a DNS-amplifikáció előtt megfelelő kenetek választhatók. Ezenkívül a domináns szervezet Gram-folt megjelenése belső minőségellenőrzésként szolgál a genotípusos azonosítás után. A fenotípusos azonosításhoz hasonlóan Vizsgálatunk eredményeit is korrelálni kell a klinikai képpel a kezelési döntések meghozatala előtt, mivel egyik módszer sem képes megbízhatóan megkülönböztetni a kolonizációt a fertőzéstől.

Az angol nyelvű szakirodalom azon kevés jelentése közül, amelyek leírják a nukleinsav visszanyerését klinikai mintákból üveglemezeken (3, 8), eddig egyik sem írta le a DNS-amplifikációt a baktériumok visszanyerése után Gram-festett tárgylemezekről. Módszerünk gyors és megbízható, és eszközként használható olyan esetekben, amikor a klinikai Gram-festett tárgylemezeken bőségesen láthatók organizmusok, de a kultúrában nem nyerhetők vissza. A technika különösen hasznos lehet, ha a diagnózist retrospektív módon vagy az eredeti minták eldobása után keresik.

• Copyright 2004 amerikai Mikrobiológiai Társaság