Bevezetés
a Kcat a forgalom száma – az egyes enzimhelyek szubsztrátmolekuláinak száma egységnyi idő alatt termékké alakul. Ha ismeri az enzimhelyek koncentrációját, akkor a szubsztrát vs.sebességgörbe elemzésekor a Vmax helyett a Kcat-ot illesztheti.
A modell
Y = Et*kcat*X/(Km + X)
X a szubsztrát koncentrációja.
Y az enzim sebessége.
a kcat a forgalom száma, az egyes enzimhelyek hányszor konvertálják a szubsztrátot termékké egységnyi idő alatt. Ezt az Y tengely időegységeinek inverzében fejezzük ki. Például, ha Y a szubsztrát mikromoljaiban van percenként, akkor kcat a katalitikus helyenként percenként előállított szubsztrátmolekulák száma.
Km a Michaelis-Menten állandó, ugyanabban az egységekben, mint X. Ez a szubsztrátkoncentráció, amely a fél maximális enzimsebesség eléréséhez szükséges.
Et az enzim katalitikus helyek koncentrációja. Ha az enzimnek több alegysége van, vegye figyelembe, hogy az Et a katalitikus helyek koncentrációja, amely nagyobb lehet, mint az enzimmolekulák koncentrációja. A beírt y értékek az enzimsebesség, amelyet koncentrációs egységekben adnak meg idő szerint. Az Et-t ugyanazokba a koncentrációs egységekbe kell beírni (míg az időegységeket a kcat határozza meg).
a Vmax az enzim maximális sebessége ugyanazon egységekben, mint Y. a fenti modellben közvetlenül nem látható. Ez az enzim sebessége extrapolálva nagyon magas szubsztrátkoncentrációkra, tehát szinte mindig magasabb, mint a kísérletben mért bármely sebesség. Ezt úgy számítják ki, hogy megszorozzuk Et szorozva kcat.
kapcsolat a Michaelis-Menten modellel
a fenti görbe megegyezik a Michaelis-Menten modell által meghatározott görbével. Azonos görbéket kap, ha bármelyik modellt illeszti az adataihoz, a Km-re pedig azonos értékeket.
a Michaelis-Menten modell megtalálja a Vmax-ot, amely a maximális enzimsebesség extrapolálva nagyon magas szubsztrátkoncentrációkra. Ugyanazokban az egységekben fejeződik ki, amelyeket az Y értékek (enzimaktivitás) megadásához használt. Általában ez egyszerű kifejezni ezt (vagy átalakítani ) MOL / perc / mg fehérje. A Vmax-ot az határozza meg, hogy hány enzimhely van jelen (Et), és az enzim milyen sebességgel képes szubsztrátot termékké alakítani (kcat).
Ha ismeri a vizsgálathoz (Et) hozzáadott enzimhelyek koncentrációját, akkor a fenti modell segítségével illesztheti a kcat katalitikus állandót.
a kcat kiszámításakor a koncentrációs egységek kialszanak, így a Kcat-ot inverz időegységekben fejezzük ki. Ez a forgalom száma – a szubsztrátmolekula száma, amelyet az egyes enzimhelyek egységnyi idő alatt termékké alakítanak.
A modell illesztése prizmával
1.Hozzon létre egy XY adattáblát. Ha több kísérleti állapota van, helyezze az elsőt az A oszlopba, a másodikat a B oszlopba stb. Kiválaszthatja a Prism mintaadatait is: enzim kinetika — Michaelis-Menten.
2.Az adatok megadása után kattintson az Elemzés gombra, válassza a nemlineáris regressziót, válassza az enzim kinetikai egyenletek panelt, majd válassza a Kcat lehetőséget.
3.Az Et-t állandó értékre kell korlátoznia, más kísérletek alapján. Az Et értékének korlátozásához lépjen a nemlineáris regresszió párbeszédpanel Constrain lapjára, győződjön meg arról, hogy az Et melletti legördülő érték “állandó egyenlő” értékre van állítva, majd írja be az értéket. A mintaadatokhoz írja be a 100 értéket Et értékként.
ha nem ismeri az Et értékét, akkor nem illesztheti be a kcat-ot, hanem a Vmax-nak kell megfelelnie. Nem lehetséges, hogy a Prism illeszkedjen mind a kcat – hoz, mind az Et-hez, mivel a két paraméter összefonódik, és a szubsztrát-sebesség görbe nem ad információt az egyes értékeikről.
4.A mintaadatokkal a Prism arról számol be, hogy Km= 5, 886, 95% – os konfidencia intervallummal, 3, 933-7, 839 között. A kcat legjobb illeszkedési értéke 13,53, 95% – os konfidencia intervallummal 11,97-15,09 között.
Megjegyzések
•Lásd az enzimkinetika összes elemzésének feltételezéseit.
•ez az egyenlet pontosan ugyanahhoz a görbéhez illeszkedik, mint a Vmax-hoz illő egyenlet, nem pedig a kcat forgalmi számához. A kcat times et terméke (az enzimhelyek koncentrációja) megegyezik a Vmax-szal.
•ez az egyenlet az alloszterikus enzimek egyenletéhez kapcsolódik. Ez az alloszterikus modell további paramétert ad hozzá: a domb lejtése h. amikor h egyenlő 1,0, a két modell azonos.