gyakran sok zavart jelent az “enzimegységek”, az “enzimaktivitás” és a “specifikus enzimaktivitás” jelentése. Ez az útmutató ezeket a kulcsfogalmakat egyszerű szavakkal magyarázza, és az enzimvizsgálatok tervezését és a lineáris tartományban történő működés fontosságát tárgyalja. Figyelembe vesszük a standard görbéket is, és azt is, hogy az X tengelyen kell-e ábrázolni a koncentrációt vagy a termék abszolút mennyiségét. Néhány tipp a vizsgálati vezérlők beállításához és az üres helyek kivonásához. Végül elmagyarázzuk, hogyan számítják ki az enzimaktivitási értékeket, és egyszerű áttekintést adunk a kinetikus egyenletekről.
az Enzimegységek meghatározása
az enzimológia kevésbé bonyolult lenne, ha mindenki ugyanazt az egységdefiníciót használná. Az alábbiakban egy standard egységmeghatározást adunk meg:
1 egység (U) az enzim mennyisége, amely percenként 1 umol szubsztrát reakcióját katalizálja (a meghatározás).
a legtöbb r &d beállításban az 1 umol szubsztrát valójában elég sok anyag, és más meghatározások előnyben részesíthetők, hogy elkerüljék a mennyiségek egységekben történő kifejezését. A következő nem szabványos meghatározást általában használják:
1 egység (U) az enzim mennyisége, amely percenként 1 nmol szubsztrát reakcióját katalizálja (B meghatározás).
vegye figyelembe, hogy a definíció változása mély hatással van a megadott egységek számára, azaz az a definíció szerint 1 enzimegység 1000 egységnek felel meg a B definíció szerint!
az enzimegységeket milli-egységben (vagy mU-ban) is kifejezheti, ami egyszerűen egy egység ezred részét jelenti, függetlenül attól, hogy az egységet hogyan határozták meg.
nyilvánvaló, hogy a csőben lévő enzim tényleges mennyisége nem változik egyszerűen az egységdefiníció megváltoztatásával, de óvatosságra van szükség a különböző szállítóktól származó minták tevékenységének összehasonlításakor. Amíg az egységdefiníciók rendelkezésre állnak, a megadott egységek számát nmol / min-re alakíthatja át, ami egyértelmű és lehetővé teszi az érvényes összehasonlításokat.
az egyértelműség kedvéért a saját munkádban inkább az ‘nmol per min’ – t (vagy ‘umol per min’ – t) használod, bár ha állandó ismétlésre van szükség, akkor egyértelműen a sokkal rövidebb ‘egység’ kifejezésnek megvan a maga vonzereje.
mi az ‘enzimaktivitás’
az aktivitást egység/ml-ben (U / ml), más szóval nmol / perc / ml-ben adjuk meg (ha a B egység definíciót elfogadták). Így az egységekben kifejezett aktivitási értékek szintén illuzórikus 1000-szeres növekedésnek vannak kitéve, ha az A egység definíciójáról B egység definícióra váltunk. Ismét nem lehet zavart, ha az aktivitást nmol / perc / ml-ben fejezzük ki, nem pedig egység / ml-ben.
mivel az aktivitás a koncentrációhoz kapcsolódik, ebből következik, hogy két enzim fiola azonos számú egységet tartalmazhat (összesen), de eltérő aktivitással (koncentrációval) rendelkezik.
mi a specifikus enzimaktivitás?
specifikus enzimaktivitás (általában egyszerűen ‘specifikus aktivitásnak’ nevezik) az enzimegységek száma/ml osztva a fehérje koncentrációjával mg / ml-ben. A specifikus aktivitási értékeket ezért egység/mg vagy nmol/min/mg formában kell megadni (ha a B egységmeghatározást alkalmazzák).
a specifikus aktivitás az enzim tisztaságának fontos mércéje, és a tiszta enzim különböző tételeinek értékeinek azonosnak kell lenniük, normál kísérleti hibán belül.
az enzimoldatok Soros hígításai eltérő enzimaktivitási értékekkel rendelkeznek, de azonos specifikus aktivitási értékekkel, mivel a specifikus aktivitás kiszámításakor a számlálót (egység/ml) és a nevezőt (mg/ml) egyformán befolyásolja a minta hígítása.
bár a specifikus aktivitás nagyon különbözik az aktivitástól, a specifikus aktivitás kiszámítása ennek ellenére az aktivitás értékétől függ, ezért a megadott specifikus aktivitási érték az enzimegység meghatározásától is függ. Azok a tételek, amelyek a várt specifikus aktivitási érték alatt vannak, szennyeződéseket vagy enzimmolekulákat tartalmazhatnak, amelyek denaturálódtak.
az enzimaktivitást befolyásoló tényezők
ebben a szakaszban azt tárgyaljuk, hogy egy enzimnek miért lehetnek különböző mért aktivitási értékei a különböző laboratóriumokban. Ez alatt a mért aktivitás valódi különbségeit értjük, nem pedig a különböző egységdefiníciók használata által okozott nyilvánvaló különbségeket.
a vizsgálat elvégzésének feltételei befolyásolják a jelentett aktivitási értékeket. Például a vizsgálatokat általában 20-37 Celsius C közötti hőmérsékleten végezzük. Általánosságban elmondható, hogy egy enzim aktívabb lesz 37 Celsius C-nál, mint 20 Celsius C-nál.
az enzimegység meghatározása jobban kifejezhető így:
1 egység (U) az a mennyiség, ha az enzim, amely standard körülmények között percenként 1 nmol szubsztrát reakcióját katalizálja.
sajnos a “standard feltételek” kifejezés értelmezhető, és különböző felhasználói preferenciák lehetnek, legalábbis R&d környezetben. Így tíz különböző kutatólabor (egészen helyesen) kiszámíthatja a különböző tevékenységeket ugyanazon enzimoldatra. A legtöbb kutatólabor saját ‘standard feltételeket’ állapít meg, és minden új tételt belsőleg ellenőriz. A klinikai körülmények között a standard feltételeket kifejezetten meghatározzák, és minden laboratóriumnak azonos vizsgálatokat kell futtatnia.
vizsgálatok kidolgozása és a lineáris tartomány fontossága
az enzim aktivitási értéke (egység/ml) a legfontosabb paraméter a vizsgálat kidolgozásakor. Ennek oka az, hogy a hozzáadott térfogat (azaz egységek száma) meghatározza a termékké konvertált szubsztrát mennyiségét. Ne feledje, hogy 1 egység katalizálja az 1 nmol szubsztrát percenkénti átalakítását (B meghatározás).
a jelentett egységek/ml adhatnak egy durva képet arról, hogy mennyi enzimet kell hozzáadni, de mivel az aktivitási értéket nem határozták meg az Önével azonos tesztben, szokásos az enzim soros hígításainak elkészítése (pl. log hígítások kezdetben), és az egyes hígítások rögzített térfogatának tesztelése. A vizsgálati jeltől függően (amely az átalakított szubsztrát mennyiségéhez kapcsolódik) egy második kísérletre lehet szükség a megfelelő hígítás otthonához.
pontosan mi a legjobb hígítás? Ennek megválaszolásához át kell gondolnunk a vizsgálati tervezés legfontosabb szempontját – a lineáris tartományt. Fontos, hogy a kvantitatív munka olyan tartományban működjön, amelyben a vizsgálati jel (gyakran abszorbancia) az enzimkoncentrációval szemben lineáris. A legtöbb vizsgálat lineáris, ha a szubsztrát konverzió mértéke kevesebb, mint 15%, feltételezve, hogy nincsenek más korlátozó tényezők. A vizsgálati idő (pl. 30 perc) és a hőmérséklet (pl. 25oC) rögzítésével a konverzió mértéke egyszerűen szabályozható egy paraméter, azaz a hozzáadott enzimegységek számának beállításával.
ezt grafikusan szemlélteti az 1. ábra reciprokként kifejezett hígításokkal (azaz 1/10 = 0,1 hígítás az x tengelyen). A saját diagramja eltérhet alakjában és lineáris tartományában, de nagyon magas enzimkoncentráció esetén kétségtelenül a vizsgálati jel nem növekszik a hozzáadott enzim mennyiségével arányosan.
az 1.ábrán látható vizsgálat lineáris az optikai sűrűségig (OD) 2,5, és a 0,02-es hígítási tényező (az enzim 1/50-es hígítása) ideális lenne a vizsgálati munkához, mivel nagy jelet ad (~1,5), és a lineáris tartomány közepén fekszik. A 0,04 és 0,12 közötti hígítási tényezők (azaz a csökkent meredekségű régió) eredményein alapuló számítások alábecsülik az enzimaktivitás valódi szintjét, mert valami egyértelműen korlátozza a vizsgálati jel nagyságát.
számos tényező működhet a lineáris tartomány korlátozására, és a tartomány vizsgálatonként változik. A nemlinearitás egyik gyakori oka a szubsztrát túlzott fogyasztása, ami a reakciósebesség csökkenését okozhatja, de a lemezolvasó (vagy bármilyen mérőeszköz) optikai alkatrészeinek korlátai is jelentősek lehetnek. A legtöbb lemezolvasó például nem tudja megbízhatóan mérni a 3 feletti abszorbancia értékeket, és ez a korlátozás a termékké alakított szubsztrátum százalékos arányától függetlenül érvényes.
1.ábra. Abszorbancia Versus az enzim mennyisége
bár ebben az útmutatóban másképp nem tárgyaljuk, tisztában kell lennünk azzal is, hogy az enzimek idővel denaturálódhatnak, különösen, ha nagyon híg, és egyes reakciók termékei gátolhatják az enzimet. Valójában a nemlineáris viselkedésnek más lehetséges okai is vannak, de általában viszonylag könnyű megtalálni a lineáris tartományt az enzim fent leírt soros hígításával.
vizsgálati idő és hőmérséklet
ezek a paraméterek befolyásolhatják a lineáris tartományt is, mivel befolyásolják a szubsztrát konverziójának sebességét. Például egy vizsgálat 15 perc elteltével lineáris lehet, de 60 perc elteltével túl sok szubsztrátot fogyaszthattak el. Ebben a helyzetben csökkentenie kell az enzim mennyiségét annak érdekében, hogy a vizsgálatot 60 percig futtassa. Ugyanezek a megfontolások vonatkoznak a vizsgálati hőmérsékletre is, mivel ez befolyásolhatja a reakció sebességét is.
a legtöbb ember elfogadja a vizsgálati időt valahol 15 perc és 60 perc között. Nagyon rövid idő (pl. 2 perc) kerülendő, mert a reakció leállításának enyhe késleltetése jelentős hibához vezet az aktivitás kiszámításában. Fontos annak biztosítása, hogy a hűtőszekrényben vagy fagyasztóban tárolt reagensek használat előtt a megfelelő hőmérsékletre egyensúlyozzanak, és ez különösen fontos, ha viszonylag rövid a vizsgálati ideje.
vizsgálati térfogat/érzékenység
gyakorlati szempontból a vizsgálati térfogatot a vizsgálatokhoz használt fogyóeszköz határozza meg/korlátozza (pl. küvetták, csövek vagy mikrolemezek). A legtöbb enzimvizsgálatnál a jel arányos a vizsgálati térfogattal, és a vizsgálat miniatürizálására tett kísérletek (pl. reagensek megőrzése) általában alacsonyabb jelekhez vezetnek. Az abszorbancia-vizsgálatok azonban gyakran kivételt képeznek, és például egy 3 ml-es küvettáról 1 ml-es mikroküvettára történő váltás nem változtatja meg az abszorbancia-értéket, ha a küvett szélessége (úthossz) még mindig 1 cm (azaz. a fény még mindig azonos hosszúságú folyadékon halad át). Ennek oka az, hogy az abszorbancia arányos az út hosszával, nem pedig a minta térfogatával.
mikrolemezes abszorbancia vizsgálatokban az út hossza megegyezik a folyadék mélységével, és a kutak átmérőjének csökkentésével és a folyadék állandó mélységének fenntartásával a jelveszteség nélkül miniatürizálható. Például 96 kútlemez könnyen befogadhat 200ul mintát, de 50ul vizsgálati térfogat esetén jobb lenne egy 384 kútlemezt használni, hogy növelje az út hosszát az 50ul mintával Egy 96 lyukú lemezen látotthoz képest.
folyamatos vizsgálatok (a termék időbeli megjelenésének mérése)
a legtöbb vizsgálatot rögzített ideig (végpontvizsgálatok) végezzük, és a reakciót stop reagens (pl. sav) hozzáadásával leállítjuk. A folyamatos vizsgálatok során azonban a termék megjelenését (ritkábban a szubsztrát fogyasztását) folyamatosan rögzítik (pl. segítségével egy diagram felvevő). Ugyanezek az alapvető szabályok érvényesek; egy meghatározott mennyiségű enzim jelének időhöz viszonyított diagramjának lineárisnak kell lennie, és a sebességnek meg kell duplázódnia, ha az enzim mennyisége megduplázódik. Mindaddig, amíg a vizsgálatot lineáris tartományban végzik, a megfelelően hígított ‘ismeretlenek’ aktivitása pontosan meghatározható a standardokkal mért kezdeti reakciósebességekből.
milyen Szubsztrátkoncentrációt kell használnom?
a szubsztrát koncentrációja befolyásolja a reakció sebességét, de számos tényezőt kell figyelembe venni a megfelelő koncentráció kiválasztásakor. Gyakorlati szempontból az egyik legfontosabb szempont a termék mennyisége, amelyet létre kell hozni ahhoz, hogy mérhető vizsgálati jelet adjon. Mivel az enzimreakció sebessége valószínűleg csökken, ha a szubsztrát több mint 15% – át hidrolizálták, a szubsztrát kezdeti koncentrációjának általában legalább 10-szeresének kell lennie annak a termékkoncentrációnak, amelyről ismert, hogy elfogadható vizsgálati jelet ad.
egy másik szempont a szubsztrátum Km-je. Míg több szubsztrát hozzáadása általában azt jelenti, hogy magasabb aktivitási értékeket fog látni, a kapcsolat nem lineáris, és a szubsztrát költségét figyelembe kell venni. Ezen a ponton valószínűleg hasznos bevezetni a klasszikus Michaelis-Menten egyenletet:
v = (Vmax s)/(Km + s) ……………. Eqn. (1)
ahol v A sebesség, Vmax a lehető legnagyobb sebesség, S a szubsztrátkoncentráció, Km pedig megegyezik azzal a szubsztrátkoncentrációval, amely a maximális aktivitás felét adja. Ennek az egyenletnek a levezetése és az alapul szolgáló feltételezések megtalálhatók bármely enzimkinetikáról szóló tankönyvben. Bár normális az enzimreakciók sebességének mérése, nem pedig kiszámítása, hasznos megérteni az alapelveket a vizsgálat megtervezése céljából.
a Michaelis-Menten egyenlet hasznos, mivel segít kiválasztani a szubsztrát megfelelő koncentrációját, ha a Km ismert.
amikor S = Km, v = (Vmax S)/2S, azaz v/Vmax = S/2s=++.
más szavakkal, az enzim a lehető legnagyobb sebesség 50% – án fog működni, ha S=Km.
az 1.egyenletbe az S = 10 és Km = 1 értékek helyettesítésével látni fogja, hogy a szubsztrátkoncentráció 10-szeresének növelésével az enzim a lehető legnagyobb sebesség ~90% – án működik, 50% helyett. Nyilvánvaló, hogy ez magasabb, de nem 10-szer magasabb.
nagyon magas szubsztrátkoncentráció esetén az 1. egyenletben szereplő Km számszerűen jelentéktelenné válik, és a mért sebesség ekkor megegyezik a Vmax értékkel.
sok vizsgálatot végeznek a szubsztrátkoncentrációval a Km értéken vagy annak környékén, de ha a Km nagyon magas, előfordulhat, hogy nem lehet ilyen magas szubsztrátkoncentrációt használni (pl. költség vagy korlátozott oldhatóság miatt).
bizonyos helyzetekben tanácsos lehet viszonylag alacsony szubsztrátkoncentrációt használni. Például a gyógyszerészeti gyógyszerfelfedezésben egy nagyon magas szubsztrátkoncentráció alkalmazása megnehezítené a Kompetitív enzim inhibitorok azonosítását (a Kompetitív inhibitorok ugyanahhoz a helyhez kötődnek, mint a szubsztrát).
meg kell találni a különböző tényezők egyensúlyát, hogy a vizsgálat mérhető jelet kapjon, lineáris tartományban működtethető legyen, és bármilyen más vizsgálati célt (pl. költség, idő stb.) teljesítsen.
Standard görbék
az enzimaktivitás kiszámításához mindig standard görbére van szükség. Nem elengedhetetlen, ha csak a relatív aktivitási értékek érdeklik.
a standard görbe úgy van kialakítva, hogy a vizsgálati jelet a reakciótermék standard oldataival megfelelő koncentrációtartományban mérjük. Ideális esetben minden kísérlethez szabványos görbét kell futtatnia, de ha a standard görbe nagyon reprodukálható, elfogadható lehet periodikusan futtatni.
az alábbi 2. ábra egy tipikus standard görbét mutat be. Ez egy standard görbe egy ATPáz vizsgálathoz, amelyben az ATP hidrolizálódik ADP-vé és Pi-vé (szervetlen foszfát).
2.ábra. Standard görbe Pi
a foszfátot olyan festékkötő reagenssel detektáljuk, amely foszfát jelenlétében megváltoztatja a színét. Ennek a tesztnek a sajátosságai azonban itt nem fontosak; függetlenül a termék jellegétől vagy az alkalmazott kimutatási módszertől, szabványos görbét kell kialakítani, amely megmutatja a jel függését a vizsgálatban szereplő termék mennyiségétől. A ‘görbe’ (ideális esetben egyenes) az ismeretlen aktivitású mintákban keletkező termék mennyiségének meghatározására szolgál, azaz az abszorbancia értékéből, az X tengelyen lévő metszet leolvasásával. (A legtöbb grafikus szoftvercsomag automatikusan kiszámítja az x értékeket az y mért értékeiből). A tevékenység mennyisége ezután kiszámítható (lásd később).
a koncentrációt vagy az abszolút mennyiséget ábrázolom az X tengelyen?
itt nincs egyetlen helyes válasz, és a megközelítés használatának lehetősége gyakran zavart okozhat az aktivitási értékek kiszámításakor. Például a termék nmol ábrázolása az x tengelyen nagyon kényelmes, ha ki kell számítania az aktivitási értékeket (ne feledje, aktivitás = nmol per perc / ml). A laboratóriumi reagenseket azonban általában ismert koncentrációban állítják elő, és ezeket az értékeket gyakran könnyebb ábrázolni az x tengelyen. Az enzim aktivitásának (vagy specifikus aktivitásának) kiszámításakor azonban emlékeznie kell arra, hogy az x tengelyen lévő koncentrációt átalakítsa a képződött termék nmoljainak számává, ami azt jelenti, hogy figyelembe kell vennie a vizsgálati térfogatot. Az ok könnyen érthető: Egy standard oldat 50ul és 100ul térfogata azonos koncentrációban lesz, de a nagyobb térfogat kétszer annyi terméket tartalmaz. Általában a legjobb, ha egy megközelítést választunk (azaz vagy a termék abszolút mennyiségét vagy koncentrációját ábrázoljuk), hogy mindig ugyanazt a módszert alkalmazzuk az aktivitás kiszámítására.
A kontrollok és a ‘üres’ adatok kivonása
a megfelelő kontrollok létfontosságúak a kvantitatív munka szempontjából, csakúgy, mint a kontrolladatok helyes felhasználása a számításokban.
A kontrollok (közvetve) megmondják, hogy a vizsgálati jel mekkora része az enzim hatásának köszönhető, és mennyi más okból keletkezik. A hamis jel gyakori forrása a szubsztrát (amely gyakran szennyezett lehet a termékkel). Más vizsgálati komponensek is kis jelzést adhatnak az összetevők jellegétől és a vizsgálat típusától függően. A kontrollok célja, hogy lehetővé tegyék a teljes jel bármely olyan elemének eltávolítását (kivonással), amelyek nem kapcsolódnak az enzim hatásához. Ha a vizsgálat jól megtervezett és a vizsgálati reagensek jó minőségűek, a kontrollok kezelése általában meglehetősen egyszerű.
az alábbiakban néhány általános irányelvet adunk meg:
ha visszatérünk a szervetlen foszfát kimutatására szolgáló kolorimetriás vizsgálathoz, kiemelhetünk néhány lehetséges problémát, amelyek megfelelő kontrollokkal könnyen kimutathatók.
a foszfát detektáló reagens alacsony, körülbelül 0,08 értéket ad egy 96 lyukú lemezen a méréshez használt hullámhosszon (körülbelül 650 nm).
a következő vizsgálatokat/kontrollokat állíthatjuk be (hipotetikus vizsgálati helyzetben zárójelben):
- minden vizsgálati komponens mínusz enzim (0,5)
- enzim önmagában (0,1)
- enzim plusz az összes többi komponens (1,8)
nyilvánvaló, hogy az 1,8 vizsgálati jel nem kizárólag az enzim szubsztrátra gyakorolt hatásának köszönhető.
bármely enzimvizsgálat esetében a legfontosabb kontroll (A) az enzim kihagyása (és pufferrel való helyettesítése). Ez megadja az összes többi vizsgálati komponens háttérjelét csoportként, beleértve az aljzatot is, amely kis mennyiségű terméket tartalmazhat. Ez a kontroll nem mondja meg az enzim háttérjelét, de nyilvánvalóan nem adhatja hozzá az enzimet a szubsztrátumhoz kontrollként! A legtöbb vizsgálatban az enzim nem ad jelet, mert a vizsgálat során történő felhasználás előtt jelentősen hígítják. Ez könnyen ellenőrizhető, mint a fenti B-ben.
a fenti a mintára vonatkozó adatok arra utalnak, hogy a keverék szervetlen foszfáttal szennyezett. Az egyes összetevők ezután ellenőrizhetők a probléma forrásának azonosítása érdekében. Ez a helyzet meglehetősen gyakori az Atpázok és más foszfáttermelő enzimek vizsgálatánál, mivel a szubsztrátok gyakran instabilak és részlegesen hidrolizálódnak, hogy szervetlen foszfátot kapjanak.
kínos lehet a nyers adatok kijavítása, ha több komponens hamis jeleket ad; a probléma kiküszöbölése a forrásnál általában sokkal jobb, mint bármely matematikai kezelés. A fenti C minta korrigált értéke 1,2-nek tűnhet (azaz. 1.8 – 0.5 – 0.1) de szigorúan véve ez rossz. Ne feledje, hogy a vizsgálati lemez plusz detektáló reagens 0,08 körüli háttérjelet ad, így az a vezérléshez szükséges jel nagy részének forrása a lemez műanyaga és/vagy a detektáló reagens. Ugyanazt a kis jelet is el kell rejteni az enzimkontroll értékén belül. Így a fenti korrekcióban ezt a rejtett üreset kétszer vontuk le.
mindig ki kell vonnia a kontrollokat a vizsgálati adatokból, és célszerű az összes anyagot (az enzim kivételével) kombinálni, és egyetlen értéket kivonni. Ha ezt a megközelítést alkalmazzuk, a standard görbét ugyanúgy kezeljük, és levonunk egy kontrollértéket (azaz a termék hiányában kapott értéket, azaz a fent tárgyalt lemez/reagens vakpróba analógját). Így sem a kivont vizsgálati adatok, sem a kivont standard görbe nem tartalmazza a lemez/vizsgálati reagens által okozott potenciálisan félrevezető háttérjelet.
végül, amint láttuk, a hamis jelek megfelelő vezérléssel könnyen észlelhetők, de a jó minőségű adatok megszerzésének legjobb stratégiája az alacsony háttérrel rendelkező reagensek használata, hogy a vezérlési értékek alacsonyak legyenek. Hasznos olyan vizsgálati jelet is generálni (az enzim miatt), amely jóval magasabb, mint bármely háttérjel. Ideális esetben a jel-háttér aránynak legalább 5-nek, előnyösen 10-nek vagy annál nagyobbnak kell lennie a pontos mennyiségi munka érdekében.
az aktivitási értékek kiszámítása
ezt meglehetősen könnyű megérteni, ha a nyers vizsgálati adatokból lépésről lépésre számítunk vissza. Tegyük fel például, hogy enzimreakciónk során 10nmol terméket generáltunk (azaz a jel standard görbéje alapján határoztuk meg a termék abszolút mennyiségével szemben). Mivel az aktivitást nmol / perc / ml-ben fejezzük ki, figyelembe kell vennünk az időt és a térfogatot, és talán kevésbé nyilvánvalóan az enzim mennyiségét és hígítását az aktivitás kiszámításához.
Ha a vizsgálat 10 perc hosszú, akkor a fenti példában az nmol / perc száma 1. (1. lépés)
ha a vizsgálati térfogat 200ul, meg kell szoroznunk 5-tel (azaz 1000/200), hogy nmol / perc / ml legyen. (2. lépés)
Ez az érték az enzim aktivitására vonatkozik a vizsgálatban, nem pedig a vizsgálat beállításához használt enzim mintájára. Néhány további korrekciós tényezőre van szükség az enzimaktivitás meghatározásához az eredeti enzimmintában.
lehet, hogy az enzimet használat előtt hígították, és a vizsgálatban jelen lévő többi komponenssel tovább kell hígítani. Ha a vizsgálat (összesen 200ul) 20ul enzimet tartalmaz, és az enzimet 1/100-mal előre hígítjuk a 20ul minta hozzáadása előtt, akkor valószínűleg láthatjuk, hogy először 10-gyel (3.lépés), majd 100-zal (4. lépés) kell szoroznunk, hogy az enzim aktivitását az eredeti enzimoldatban kapjuk meg.
eddig ez viszonylag egyszerű. Korábban azonban említettük, hogy a koncentrációt gyakran ábrázolják a standard görbe x tengelyén. Így az értékek mM-ben (nem mmol) fejezhetők ki, és a standard görbe ellenőrzésével nem lehet meghatározni a mmol számát.
mivel a mM literenként mmol-t jelent, eltérés van az 1L implicit térfogat és a tényleges vizsgálati térfogat között. Így ha 10 mm-es termékünk van, és a vizsgálati térfogat 200ul, akkor el kell osztanunk 5000-rel, hogy megkapjuk a termék mmoljainak számát.
itt észreveheti, hogy az 5000-rel való osztás itt ellensúlyozza a fent szükséges szorzási műveletek egy részét. Valójában teljesen normális, ha a korrekciós tényezők megszűnnek. Például egy 10 perces vizsgálatban 1/10 hígított enzimet használva 10-gyel osztjuk meg, hogy nmol / perc értéket kapjunk, majd később 10-gyel szorozzuk meg, hogy korrigáljuk a hígítási tényezőt.
ebből következik, hogy ha mindig szabványos vizsgálati feltételeket használ (pl. a standard görbéből származó ‘x’ értéket egyetlen globális korrekciós tényezővel szorozhatja meg, amely magában foglalja az összes többi egyedi korrekciós tényezőt, hogy kiszámítsa az aktivitási értékeket. Csak az első alkalommal kell azonosítania az egyes korrekciós tényezőket.
Enzimgátlás / Gyógyszerszűrés
Ez az enzimológia olyan területe, ahol továbbra is szükség van a lineáris tartományban történő működésre, de ahol az aktivitási értékek kiszámítása általában nem releváns; inkább a reakció relatív sebessége (vagy a képződött termék relatív mennyisége) a vizsgált anyag jelenlétében és hiányában kulcsfontosságú, ami a vakpróbával kivont vizsgálati adatokat használó egyszerű számításoknál alig igényel többet. A vakok kivonása után a képződött termék mennyiségét a vizsgált anyag hiányában kapott mennyiség százalékában (azaz 100%) fejezzük ki. Ezeket a vizsgálatokat néha meglehetősen alacsony jel-háttér arányokkal lehet lefuttatni, mert a feltett kérdés – gátolja-e a vizsgált anyag a reakciót?
– csak igen/nem választ igényel.
Összefoglalás
Ez az útmutató remélhetőleg világos magyarázatot adott az ‘enzimegységekre’, az’ enzimaktivitásra ‘és a’ specifikus enzimaktivitásra’, valamint az egységdefiníciókra és a’lineáris tartomány’ fontosságára. A specifikációk, hogy mit kell ábrázolni a standard görbék x tengelyén, a felhasználói preferencia kérdése, de a tevékenységek kiszámításakor némi óvatosságra van szükség. A vizsgálati ellenőrzések fontosak, de a kiváló minőségű reagensek használata jobb, mint a háttér eltávolítása matematikai megközelítésekkel. A kvantitatív munkához kívánatos a magas jel-háttér arány, és számos paraméter változtatható a vizsgálati jel növelése érdekében; nem mindig szükséges egyszerűen több enzim hozzáadása. Az enzimaktivitási értékek könnyen kiszámíthatók, ha lépésenkénti megközelítést alkalmaznak a kulcsfontosságú vizsgálati változók azonosítására.
további protokollok és útmutatók