nagy teljesítményű folyadékkromatográfia a tömegspektrometria egy rendkívül sokoldalú instrumentális technika, amelynek gyökerei a hagyományosabb folyadékkromatográfia alkalmazásában rejlenek olyan elméletekben és műszerekben, amelyeket eredetileg a gázkromatográfiához (GC) fejlesztettek ki. Ahogy a neve is sugallja, a műszer egy nagy teljesítményű folyadékkromatográfot (HPLC) tartalmaz, amely megfelelő interfészen keresztül csatlakozik egy tömegspektrométerhez (MS). A HPLC/MS elsődleges előnye a GC/MS-hez képest az, hogy képes az összetevők sokkal szélesebb körének elemzésére. A termikusan labilis, nagy polaritású vagy nagy molekulatömegű vegyületek mind elemezhetők HPLC/MS alkalmazásával, még a fehérjék is rutinszerűen elemezhetők. Az érdeklődésre számot tartó mintákból származó oldatokat egy keskeny (általában 150 mm hosszú és 2 mm belső átmérőjű vagy kisebb) rozsdamentes acélcsövet tartalmazó HPLC oszlopra fecskendezik, amely finom, kémiailag módosított szilícium-dioxid részecskéket tartalmaz. A vegyületeket e részecskék kémiai bevonatával (állófázis) és az oszlopon keresztül eluáló oldószerrel (mozgófázis) való viszonylagos kölcsönhatásuk alapján választjuk el egymástól. A kromatográfiás oszlopból eluáló komponenseket ezután egy speciális interfészen keresztül vezetik be a tömegspektrométerbe. A HPLC/MS-hez leggyakrabban használt interfészek az elektrospray ionizáció és a légköri nyomású kémiai ionizációs interfészek.
elektrospray ionizáció
az elektrospray ionizáció során az analitot jellemzően 1-es nagyságrendű áramlási sebességgel vezetjük be a forrásba. A vizsgált oldat áramlása áthalad az elektrospray tűn, amelynek nagy potenciálkülönbsége van (a rá alkalmazott ellenelektródhoz képest) (jellemzően 2,5-4 kV tartományban). Ez arra kényszeríti a töltött cseppek permetezését a tűről ugyanolyan polaritású felületi töltéssel a tű töltésére. A cseppeket a tűről a számláló elektródán lévő forrás mintavételi kúp felé taszítják (kék színnel látható). Amint a cseppek áthaladnak a tű hegye és a kúp közötti térben, az oldószer elpárolog. Ez a füge körül van körözve.1.és az ábrán nagyítva.2. Amint az oldószer elpárolog, a csepp addig zsugorodik, amíg el nem éri azt a pontot, hogy a felületi feszültség már nem képes fenntartani a töltést (a Rayleigh-határ), amikor egy “Coulombikus robbanás” következik be, és a csepp szétszakad. Ez kisebb cseppeket eredményez, amelyek megismételhetik a folyamatot, valamint meztelen töltésű analitmolekulákat. Ezek a töltött analitmolekulák (nem szigorúan ionok) egyenként vagy többször tölthetők. Ez egy nagyon puha ionizációs módszer, mivel az ionizáció során az analit nagyon kevés maradék energiát tart fenn. A többszörösen töltött molekulák előállítása lehetővé teszi a nagy molekulatömegű komponensek, például a fehérjék elemzését, mivel a tömegspektrométer tömegtartománya jelentősen megnő, mivel valójában a tömeg / töltés arányt méri, nem pedig a tömeget önmagában. A technika fő hátránya, hogy nagyon kevés (általában nem) fragmentáció keletkezik, bár ezt tandem tömegspektrometriás technikák, például MS/MS vagy MSn alkalmazásával lehet leküzdeni.
1.ábra egy ESI interfész vázlata
2. ábra az ionképződés mechanizmusának vázlata
légköri nyomás kémiai ionizáció
légköri nyomás kémiai az ionizáció (apci) a kémiai ionizáció (ci) analóg ionizációs módszere. A jelentős különbség az, hogy az APCI légköri nyomáson fordul elő, és elsődleges alkalmazási területei az alacsony tömegű vegyületek ionizációja (az APCI nem alkalmas termikusan labilis vegyületek elemzésére). Az általános forrás beállítása (Lásd az ábrát. 3) erősen hasonlít az ESI-hez. Ahol az APCI különbözik az ESI-től, az ionizáció módja. Az ESI-ben az ionizációt a permetező tű és a kúp közötti potenciális különbség révén vásárolják meg, gyors, de enyhe dezolválással. Az APCI-ben az analit oldatot egy pneumatikus porlasztóba vezetjük be, majd egy fűtött kvarccsőben feloldjuk, mielőtt kölcsönhatásba lépnénk a koronakisüléssel, ami ionokat hoz létre. A Koronakisülés helyettesíti a CI-ben lévő elektronszálat – a légköri nyomás gyorsan “kiégeti” az összes szálat -, és elektronionizációval primer N2 ++ + és N4 ++ + – t hoz létre. Ezek az elsődleges ionok ütköznek a párologtatott oldószermolekulákkal, hogy másodlagos reagens gázionokat képezzenek – pl. H3O + és (H2O) nH+ (Lásd az ábrát. 4). Ezek a reagens gázionok ezután ismételt ütközéseken mennek keresztül az analittal, amelynek eredményeként analitionok képződnek. Az ütközések nagy gyakorisága magas ionizációs hatékonyságot és a vizsgált ionok hőkezelését eredményezi. Ez túlnyomórészt molekuláris fajok és adduktionok spektrumát eredményezi, nagyon kevés fragmentációval. Amint az ionok kialakulnak, nagyjából ugyanúgy lépnek be a szivattyúzási és fókuszálási szakaszba, mint az ESI.
3. ábra egy APCI forrás összetevőinek vázlata
4. ábra az APCI mechanizmusának részletesebb áttekintése
diagramok és szöveg (részleges) Dr. Paul Gates, iskola kémia, Bristoli Egyetem