a fehérjeszintézis nyúlási fázisának transzlokációs lépése során az mRNS-t egy kodon továbbítja, összekapcsolva a tRNS-eknek a riboszomális a (aminoacil) – ból P (peptidil) és P-ből E (kilépési) helyekre történő mozgásával, az EF-G nyúlási faktor által katalizált folyamatban (1). Először a tRNS-ek az 50S alegységen P/E és a/P hibrid állapotokba mozognak, majd ezt követi a tRNS anticodon stem-loops (ASLs) mozgása a 30S alegység a és P helyeiről a P és E helyekre, a kapcsolódó mRNS kodonok mozgásához kapcsolódva (2). Az első lépést az intersubunit rotáció (3-7) kíséri, míg a második lépéshez EF-G·GTP szükséges, és magában foglalja a 30S alegység fejtartományának forgatását (8-11). Bár a közelmúltban sokat tanultak a P-tRNS e helyre történő mozgásának szerkezeti alapjáról (9, 10, 12, 13), Az A-tRNS-t tartalmazó transzlokációs intermediereket nehezebb csapdába ejteni. Így az a-tRNS és az mRNS mozgás szerkezeti alapjaira vonatkozó gondolkodásunk nagy része az EF-G kristályszerkezetein alapult, amelyek az üres (14) vagy P-tRNS-tartalmú riboszóma komplexekhez vannak kötve, amelyek klasszikus (15) vagy hibrid állapotokba (10, 12, 13) és a 70S riboszóma-EF-G komplexek két krio-EM struktúráján alapulnak, amelyek két tRNS-t tartalmaznak P/E és A/P* hibrid állapotokba (16), vagy ap/P és pe/E kiméra hibrid állapotokba (11).
itt egy 70s riboszóma transzlokációs köztitermék kristályszerkezetéről számolunk be, amely EF-G – t, mRNS-t és két tRNS-t tartalmaz-egy pe/E állapotban kötött deacilált tRNS-t és egy ap/ap kiméra hibrid állapotban csapdába esett peptidil-tRNS-t. A komplexet T. thermophilus 70s riboszómákkal, egy 39-nukleotid mRNS-sel, a P helyen elongator trnamettel, az a helyen pedig N-acetil-Val-trnavallal alakították ki. A transzlokációs köztitermék befogásához neomicint adtunk a transzlokáció befejezésének megakadályozására, fuzidinsavat pedig az EF-G felszabadulásának megakadályozására (kiegészítő módszerek; ábra. S1). A szerkezetet diffrakciós adatok felhasználásával oldottuk meg 3,8-ig Egykristályból nyert (S1 táblázat). Az elektron sűrűségére példákat mutatnak be kiegészítő anyagok (füge. S2-S13). A klasszikus állapotú riboszómához (17) képest a 30-as évek alegységének feje az óramutató járásával ellentétes irányban nagy, 21-es, a 30-as évek testének pedig 2,7-es forgása van az 50-es évek alegységéhez képest (ábra. 1, 2a.ábra, B). A P-tRNS anticodon stem-loop (ASL) a 30s fejjel a 30S fej P helye és a 30S test E helye közötti helyzetbe mozog (pe kiméra állapot; 1D, e ábra), míg akceptor vége teljesen az 50S e helyre (1C ábra) mozog, pe/E kiméra hibrid állapotot képezve (9-11). Az a-tRNS ASL a 30-as test P-hely elemeinek ~4-en belül mozog (ábra. 1D); könyöke a klasszikus 50s P hely felé forog, de akceptor vége az 50S alegység A és P helyei közé van kötve (ábra. 1C), ap/ap kiméra hibrid állapotot alkotva. A nagy, EF-G-függő forgása a 30S fej a mi szerkezet repositions helix H38 a 23S rRNS, amely lehetővé teszi az A-tRNS könyök, hogy elérje a helyzetét a P-hely tRNS könyök (ábra. S14). Az EF-G IV doménje be van ékelve az a-site mRNS kodon konvergenciájának helyébe, az ap/ap tRNS anticodon hurkába, valamint a 16S és 23S rRNS-ekbe a B2A interszubunit hídnál, egyidejűleg érintkezve mind a négy RNS-sel (ábra. S15).
(a) 70s riboszóma tRNS-ekkel, amelyek klasszikus a/A és P/P állapotokba vannak kötve (17); (B) Transzlokációs köztes komplex, amely a köztes kiméra hibrid ap/ap és pe / e állapotokba csapdába esett tRNS-eket mutatja. C) a tRNS pozícióinak összehasonlítása a klasszikus állapotokban és a transzlokációs köztitermékben, az 50S alegységre igazítva; D) a tRNS asls relatív pozíciói, a 30S alegység testére vagy (E) fejére igazítva. A molekuláris komponensek a következők szerint vannak színezve: 16S rRNS, Cián; 30S fehérjék, kék; 23S rRNS, szürke; 5S rRNS, Világoskék; 50S fehérjék, bíbor; mRNS, zöld; a/A és ap/ap tRNS-ek, sárga; P/P és pe/e tRNS-ek, piros; EF-G, narancssárga.
(a–B) a tRNS pozíciói az (a) klasszikus állapotú riboszómában és (B) transzlokációs köztes. C-D) a tRNS ASL-ek és az mRNS kölcsönhatása a (C) A és P klasszikus állapotokból a (D) ap és pe kiméra hibrid állapotokba való elmozdulás során. (E–F) A 966 hurok (h31) átrendezése 16S rRNS a 30S alegység fejében (e) klasszikus P-tRNS-kötési helyzetéből (F) felülethez illeszkedő zsebet képez az ap/ap tRNS ASL körül.
bár a 30S fej forgása egyértelműen megkönnyíti a P-hely ASL transzlokációját (9-11), Az A-hely ASL-t egy másik mechanizmus transzlokálja. A P-hely ASL pontosan mozog a 30S fej forgásával a pe / E állapotba, míg az A-hely ASL tovább haladt, mint a fej forgási mozgása az ap állapotba a 30S alegységen (ábra. 1E). Az A-site ASL pontosan a fej forgásával történő mozgása súlyos ütközést eredményezne az EF-G IV doménjével, mivel a komplexünkben helyezkedik el, ami a IV domén csúcsa és az ap/ap tRNS kodon-anticodon spirálja között kialakult érintkezéssel együtt azt sugallja, hogy az mRNS és az ASL mozgása összekapcsolódik a IV domén mozgásával. az ap/ap ASL további elmozdulása közel hozza a pe/E ASL-hez (ábra). 2C, D) (11). A fej helyzete stabilizálható az 1210 foszfát 16S rRNS-je és az EF-G IV doménje közötti kölcsönhatással a Gly531 – nél.
a legszembetűnőbb a 16S rRNA 966 hurok átrendeződése a 30S fejben, amely elszakad a P helytől, hogy elérje az a helyet, ahol kapcsolatot kezdeményez a részben áttelepített ap/ap-ASL-lel (ábra. 2E, F). Ez az átrendeződés magában foglalja az m22G966 csomagolásának megszakítását a p-hely ASL (18, 19) ribóz 34-jével szemben, valamint az ap/ap-ASL körül egy felülethez illeszkedő zseb kialakulását az a965, m22G966 és C1400 nukleotidok által. A megfelelő egytrns komplex kristályszerkezetében (10) (ábra. S6), a pe/E tRNS ASL-ről kiderült, hogy fenntartja az összes kanonikus P-hely kapcsolatot a 30S fejjel, beleértve a 966 hurkot is, mivel az az E hely felé forog. Az itt közölt kéttrns komplexben azonban a P-hely 30S fej kölcsönhatásainak csak egy részhalmaza marad fenn a pe/E ASL-vel, beleértve a G1338, A1339, A1340és az uS9 fehérje C-terminális farka. A poszttranszlokációs kölcsönhatások kialakulása a pre-transzlokációs kölcsönhatások megszakításával egyidejűleg azt sugallja, hogy az ASL-ek hogyan kerülnek átadásra az A és P helyek között. Ez az érintkezők kezdeti eltolódását is jelentheti, amelyet meg kell szakítani a pe/E tRNS ASL felszabadításához a 30S fej hátsó elforgatása előtt a transzlokáció utolsó szakaszaiban (20, 21).
az EF-G IV tartományában a konzervált 1 hurok (499-504 maradékok), az ap/ap ASL és annak mRNS-kodonja közötti kölcsönhatások hálózata (ábra. S15) (11) hasonlóak a transzlokáció utáni állapotban (15) megfigyeltekhez, ami arra utal, hogy a transzlokációs ciklus során fennmaradnak. Hasonlóságuk az a1492 és az A1493 által a dekódolási helyen (22) a kodon-anticodon hélixszel végzett minor-horony kölcsönhatásokkal arra utal, hogy segíthetnek a helyes kodon-anticodon párosítás fenntartásában az A és P helyek közötti mozgás során (15), és összhangban vannak azzal a javaslattal, hogy az EF-G megkönnyíti a transzlokációt azáltal, hogy destabilizálja a kölcsönhatásokat a 30S dekódolási helyen (23).
az mRNS és a 30S fej elemei közötti kölcsönhatásokat javasolták a downstream mRNS belépési alagútban, hogy az mRNS-t előre vigyék a tRNS-sel a fej forgása során (17). Nem világos azonban, hogy az mRNS nettó mozgása ilyen módon fenntartható-e, mivel ezek a kölcsönhatások megszakadnak a fej forgása során. Megállapítottuk, hogy az mRNS kiterjesztett farka, amint az a downstream alagútból kilép, felfelé görbül, hogy az alegység fejében az uS3 fehérje felületéhez kötődjön (ábra. 3, S17). Így az előremenő fej forgása aktívan mozgatná az mRNS-t a transzlokáció irányába. A referencia nukleotid pozíciójának összehasonlítása az mRNS-en az elforgatott és nem elforgatott állapotokban azt is mutatja, hogy az előremenő fej forgása az mRNS-t egy kodonnal továbbítaná (ábra. 3D), támogatva annak lehetőségét, hogy az mRNS-t a transzlokáció során a riboszóma aktívan mozgatja. Mivel a downstream alagút méretei kizárják az RNS hélix bejutását, az mRNS másodlagos szerkezetének a riboszomális helikáz (24) általi megzavarása az alagút bejáratánál vagy annak közelében történik, az alagúton kívüli riboszómával való kölcsönhatás révén. Az mRNS farok megkötése, amely az alagút bejáratát közvetlenül a 30-as évek fejéhez köti, ilyen kölcsönhatást biztosít. A fej forgása által létrehozott erők így destabilizálhatják az alappárosítást az mRNS spirális elemeiben, amikor belépnek a downstream alagútba.
(A) a downstream mRNS belépési alagútba való belépést uS3, uS4 és uS5 fehérjék veszik körül. A +14 – +21 pozíciók érintkeznek egy pozitív töltésű tapasszal az uS3 fehérje felületén a 30-as fejben (ábra. S17). (B) a downstream mRNS útvonala és (C) 90) elforgatott nézet. (D) Dokkoló a 30S test a klasszikus szerkezet (17) (szürke) azt mutatja, hogy a forgatás a fej az ap/ap köztes szerkezet transzlokálja az mRNS egy kodon. A-kodon (sárga) és P-kodon (piros).
klasszikus állapotban a C74 és a C75 a P-hely tRNS cca farkában bázispárokat képez a G2252 és G2251, illetve a P hurok (H80) 23S rRNS, míg a C75 az A-hely tRNS Párok G2553 az a hurok (H92) (18, 25, 26). Ezek a kölcsönhatások pozícionálják a peptidil-és aminoacil-részeket a peptidil-transzferáz reakcióhoz (27), amely a P-helyen dezacilált tRNS-t, az A-helyen pedig peptidil-tRNS-t hagy. A transzlokáció kritikus lépése tehát a peptidil-CCA vég későbbi mozgása az a hurokból a P hurokba. A transzlokációs köztes szerkezet egy kiméra állapotot tár fel, amely különbözik a korábban leírtaktól (ábra. S18), amelyben a peptidil-tRNS akceptor vége egyidejűleg kölcsönhatásba lép mind az A, mind a P hurokkal (4.ábra). Ebben az állapotban a C75 bázispárosítása az a hurok G2553-jával megmarad, míg akceptor szárának a klasszikus P-hely tRNS-hez közeli helyzetbe történő mozgatása lehetővé teszi, hogy a g2252 és G2253 egy átrendezett P hurokban érintkezzen a tRNS gerincével a 72.és 70. pozícióban (ábra. 4B). Így az ap/ap-tRNS akceptor szárának vége a P hurokra van rögzítve, megkönnyítve a szomszédos C74 és C75 maradványok átvitelét az A hurokból a P hurokba. Az ap/ap tRNS A76-ja a p/p klasszikus állapotban (17) kötött tRNS-ekhez hasonlóan orientálódik, az N-acetil-valin peptidil rész a peptid kilépési alagút bejáratánál helyezkedik el, míg a C74 és a C75 fenntartja kölcsönhatását a 23S rRNS a hurokkal (ábra). 4, S19).
A és P hurkaival a transzlokáció során a peptidil-tRNS 3′ akceptor vége az (a) klasszikus a/a állapotból a (B) köztes ap/ap állapotba kerül a (C) klasszikus P/P állapotba, amelyet az A és P hurkok konformációs változásai elősegítenek.
az ap / ap-tRNS megfelelhet a kinetikusan jellemzett köztes állapotoknak. A fluoreszcencia-kioltó kinetikai vizsgálatok azonosítottak egy EF-G-függő köztiterméket (INT), amelyben a peptidil-tRNS könyök az a helyről a P hely felé mozog, de csak részben reagál az aminoacil-tRNS utánzó puromicinnel, ami arra utal, hogy CCA vége nincs teljesen beillesztve a P helyre (28). Kinetikai vizsgálatok, amelyekben egy szondát közvetlenül a peptidil-tRNS CCA végéhez rögzítettek, azonosítottak EF-G-függő transzlokációs intermediereket, amelyekben a peptidil-tRNS akceptor vége a P hely felé mozog, de puromicin-nem reagál (29). Ezen intermedierek tulajdonságai kompatibilisek az itt megfigyelt befogott ap/ap állapottal. Ennek a csapdába esett transzlokációs köztiterméknek a szerkezete kezdi leírni, hogyan mozog a tRNS a riboszomális A és P helyek között. Maguk a tRNS-kötő helyek dinamikusak, egyidejű érintkezést képeznek az A-tRNS és mind az a, mind a P helyek elemei között, hasonlítva a stafétabot áthaladásához egy váltóversenyen (30). Ez mind a 30-as, mind az 50-es évek alegységeire vonatkozik. A 30-as évek alegységében a 966-os hurok átrendezése 16S rRNS felszabadítja a G966-ot a P-site ASL-ből, hogy kapcsolatba lépjen az A-site ASL-lel, amikor az a 30-as évek p helyére lép (ábra. 2E, F). Az 50S alegységben a 23S rRNS A és P hurkai átrendeződnek, hogy mindkét hurok kapcsolatba léphessen az A-site tRNS 3 ‘ – akceptor végével, amikor megkezdi az átmenetet az 50S P helyre (ábra. 4). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a riboszomális RNS szerkezeti dinamikája aktív szerepet játszik a transzlokáció mechanizmusában.