idősebb Robert De Niro Ben született Syracuse, New York, egy ír-amerikai anya, Helen M. (N! O ‘ Reilly; 1899-1999). Helen anyja Mary E. Burns volt (John és Mary Burns gyermekeként született), apja Dennis Francis O ‘Reilly volt, aki Dundrum Ellen Hall-tól, Edward O’ Reilly második feleségétől született. Volt korábbi zavart Dennis anyaság, anyja korábban azt gondolták, hogy Edward második felesége Margaret.Robert olasz-amerikai apja, Henry Martin De Niro (1897-1976) 1887-ben Ferrazzanóból emigrált Angelina Mercurio és Giovanni Di Niro gyermekeként született.
Robert volt a legidősebb a három gyermek; ő és testvérei John és Joan nevelkedett Syracuse, New York. De Niro a híres Black Mountain College-ban tanult Josef Albers alatt 1939-től 1940-ig. Bár Albers erősen analitikus festészeti megközelítése nem vonzotta De Niro ösztönösebb stílusát, a Bauhaus mester tapasztalata és nemzetközi perspektívája mégis maradandó benyomást hagyott. De Niro Hans Hofmannnál tanult az övében Provincetown, Massachusetts nyári iskola. Hofmann tanítása az absztrakt Expresszionizmusról és a kubista formalizmusról erősen befolyásolta De Niro Érett művészként való fejlődését.
Hofmann nyári iskolájában találkozott Virginia Admiral diáktársával, akit 1942-ben vett feleségül. A pár egy nagy, tágas tetőtérbe költözött a New York-i Greenwich Village-ben, ahol festeni tudtak. Híres baráti kör vette körül magukat, többek között Ana! Nin és Henry Miller írók, Tennessee Williams drámaíró, valamint a színésznő és a híres Berlini táncos, Valeska Gert. Az admirális és De Niro nem sokkal azután váltak el, hogy fiuk, Robert De Niro Jr. 1943 augusztusában megszületett, miután De Niro melegként jelent meg. 1944-ben De Niro kapcsolatban állt Robert Duncan költővel.Miután az 1930-as évek végén és az 1940-es évek elején Hans Hofmann-nal New Yorkban és Provincetownban, valamint Josef Albers-szel az észak-karolinai Black Mountain College-ban tanult, de Niro öt évig dolgozott Hilla Rebay legendás nem objektív Művészeti Múzeumában. 1945-ben részt vett Peggy Guggenheim New York-i Art of this Century kiállításán, amely vezető Galéria volt mind az elismert európai modernisták, mind a feltörekvő absztrakt expresszionista csoport tagjai számára, mint Jackson Pollock, Mark Rothko, Robert Motherwell és Clyfford Still. De Niro első önálló kiállítása a Guggenheim galériában volt a következő év áprilisában és májusában. Ezen a ponton elsősorban absztrakt módon dolgozott, gyakran figurális hivatkozásokkal. Ebből az időszakból származó munkájának nagy része 1949-ben egy műtermi tűzben veszett el.
De Niro az 1950-es években számos önálló kiállítást rendezett A New York-i Charles Egan galériában, amelyek Willem de Kooning és más korai absztrakt expresszionista művészek munkáit mutatták be. A kritikusok dicsérték DeNiro kompozícióit, tele rögtönzött, élénk színű területekkel, amelyek helyet adtak a lazán festett csendéleteknek és a görbe aktoknak. Az 1950-es évek közepére De Niro rendszeresen szerepelt olyan fontos csoportos kiállításokon, mint a Whitney Annual, a Stable Annual és a Zsidó Múzeum. 1958-ban elnyerte a Longview Alapítvány díját.
1961-től 1964-ig De Niro Franciaországba utazott, hogy Párizsban és a környező vidéken festessen. Joseph Hirshhorn gyűjtő ebben az időszakban megvásárolta a művész számos festményét és munkáját papíron De Niro galériáján, Virginia Zabriskie-n keresztül, amelyek jelenleg a Hirshhorn Múzeum és Szoborkert állandó gyűjteményében vannak Washington DC-ben. 1968-ban Guggenheim ösztöndíjat kapott.