Nel 1970, la maggior parte della cromatografia liquida è stata eseguita utilizzando una fase stazionaria di supporto solido (chiamata anche colonna) contenente resine di silice o allumina non modificate. Questo tipo di tecnica è ora indicato come cromatografia in fase normale. Poiché la fase stazionaria è idrofila in questa tecnica, le molecole con proprietà idrofile contenute all’interno della fase mobile avranno un’alta affinità per la fase stazionaria e quindi si adsorbiranno all’imballaggio della colonna. Le molecole idrofobiche sperimentano meno affinità per l’imballaggio della colonna e passeranno da parte a parte per essere eluite e individuate in primo luogo. L’eluizione delle molecole idrofile adsorbite all’imballaggio della colonna richiede l’uso di solventi più idrofili o più polari nella fase mobile per spostare la distribuzione delle particelle nella fase stazionaria verso quella della fase mobile.
La cromatografia a fase inversa è una tecnica che utilizza catene alchiliche legate covalentemente alle particelle di fase stazionaria al fine di creare una fase stazionaria idrofobica, che ha una maggiore affinità per composti idrofobici o meno polari. L’uso di una fase stazionaria idrofobica è essenzialmente l’inverso della cromatografia di fase normale, poiché la polarità delle fasi mobili e stazionarie è stata invertita – da qui il termine cromatografia a fase inversa. La cromatografia a fase inversa impiega una fase mobile polare (acquosa). Di conseguenza, le molecole idrofobe nella fase mobile polare tendono ad adsorbirsi nella fase stazionaria idrofobica e le molecole idrofile nella fase mobile passeranno attraverso la colonna e saranno elutizzate per prime. Le molecole idrofobiche possono essere eluite dalla colonna diminuendo la polarità della fase mobile usando un solvente organico (non polare), che riduce le interazioni idrofobiche. Più la molecola è idrofoba, più fortemente si legherà alla fase stazionaria e maggiore è la concentrazione di solvente organico che sarà necessaria per eluire la molecola.
Molte delle considerazioni matematiche e sperimentali utilizzate in altri metodi cromatografici si applicano anche a RPC (ad esempio, la risoluzione di separazione dipende dalla lunghezza della colonna). Può essere utilizzato per la separazione di un’ampia varietà di molecole. In genere non viene utilizzato per la separazione delle proteine, perché i solventi organici utilizzati in RPC possono denaturare molte proteine. Per questo motivo, la cromatografia di fase normale è più comunemente usata per la separazione delle proteine. Tuttavia, la denaturazione delle proteine può effettivamente essere utile nell’analisi successiva dei campioni ottenuti dalla cromatografia. Se viene eseguita una digestione enzimatica con tripsina sulle proteine analizzate, la proteina linearizzata è più adatta a questo. Quindi, la denaturazione delle proteine utilizzando solventi appropriati che causano lo spiegamento delle proteine può effettivamente essere intenzionale prima di prelevare il campione frazionato attraverso la spettrometria di massa.
Oggi, RPC è una tecnica analitica di uso frequente. Ci sono varie fasi stazionarie disponibili per uso in RPC, permettendo la grande flessibilità nello sviluppo dei metodi della separazione.
Fasi stazionarie a base di siliceEdit
Qualsiasi sostanza polare inerte che raggiunge un imballaggio sufficiente può essere utilizzata per la cromatografia a fase inversa. La colonna più popolare è una catena di carbonio ottadecile (C18)-silice legata (classificazione USP L1). Questo è seguito da silice legata al C8 (L7), silice pura (L3), silice legata al ciano (L10) e silice legata al fenile (L11). Si noti che C18, C8 e fenile sono resine a fase inversa dedicate, mentre le colonne ciano possono essere utilizzate in modalità a fase inversa a seconda dell’analita e delle condizioni di fase mobile. Non tutte le colonne C18 hanno proprietà di conservazione identiche. La funzionalizzazione superficiale della silice può essere eseguita in una reazione monomerica o polimerica con diversi organosilani a catena corta utilizzati in una seconda fase per coprire i restanti gruppi di silanolo (end-capping). Mentre il meccanismo di ritenzione generale rimane lo stesso, sottili differenze nelle chimiche superficiali delle diverse fasi stazionarie porteranno a cambiamenti nella selettività.
Le colonne moderne hanno polarità diversa. PFP è pentafluorfenile. CN è ciano. NH2 è amminico. ODS è octadecyl o C18. ODCN è una colonna in modalità mista composta da C18 e nitrile. SCX è un forte scambio cationico (utilizzato per la separazione di ammine organiche). SAX è un forte scambio anionico (utilizzato per la separazione di composti acidi carbossilici).