Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le normative pertinenti. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti.
Materiale
Sono state confrontate le seguenti medicazioni in argento: Acticoat (Smith & Nephew, UK; indicato in questo articolo come Ac), Aquacel Ag + Extra (Convatec, UK; indicato in questo articolo come Aq), Silvercel Idro-Alginato (Systagenix, UK; di cui al presente articolo come Sc), e Ialugen Plus (IBI, Repubblica Ceca; di cui al presente articolo come Ia).
Altre sostanze chimiche sono state ottenute da Sigma–Aldrich (St. Louis, USA) se non diversamente indicato.
Preparazione di estratti
In diversi saggi, sono stati utilizzati estratti di medicazioni piuttosto che le medicazioni stesse. Questi estratti sono stati preparati utilizzando soluzione salina fisiologica (0,9% (p / v) NaCl) o terreni di coltura cellulare integrati con siero bovino fetale al 10% (FBS). Il rapporto tra l’area di medicazione e la soluzione era di 1 cm2 per 4 ml di soluzione. L’estrazione è stata eseguita per 72 h a RT con agitazione costante. Gli estratti sono stati sterilizzati facendoli passare attraverso un filtro da 0,2 µm e conservati a 4 °C fino all’uso.
Misurazione della concentrazione di argento
Le concentrazioni di argento nelle medicazioni e negli estratti delle medicazioni sono state misurate utilizzando ICP-OES. La concentrazione di argento è stata valutata anche in campioni di pelle di suini ex vivo. 10-70 mg di ciascun campione sono stati trasferiti in un recipiente di PTFE per la digestione a microonde. Quindi, 1 mL di acido nitrico concentrato (trace analysis grade, Analytika Ltd., Repubblica Ceca), 0.8 mL di acido cloridrico concentrato (trace analysis grade, Analytika Ltd., Repubblica Ceca) e 0,2 ml di perossido di idrogeno (p. a. 30%, Penta Ltd., Repubblica Ceca) sono stati aggiunti. Il campione è stato digerito a 150 °C per 5 min e poi, nella seconda fase dello stesso ciclo, a 200 °C per 10 min. Dopo la digestione, il campione è stato trasferito quantitativamente utilizzando 0,2 ml di perossido di idrogeno e acqua deionizzata.
L’analisi è stata eseguita con uno strumento ICP-OES (Radial 725, Agilent Technologies, Australia) dotato di nebulizzatore pneumatico Sea-spray e camera di nebulizzazione ciclonica. La quantificazione si basava sulla calibrazione esterna. L’accuratezza e l’affidabilità del metodo sono state testate utilizzando campioni di pelle suina con concentrazioni note di Ag provenienti da una soluzione di riferimento certificata (Analytika Ltd., Repubblica Ceca).
Microscopia elettronica a scansione
Le analisi di microscopia elettronica a scansione (SEM) sono state eseguite utilizzando uno strumento Zeiss Ultra Plus (Zeiss, Germania). I campioni sono stati rivestiti con un sottile strato di Au / Pd in un Quorum SC7620 sputter coater. Le immagini sono state scattate da due rivelatori secondari di elettroni InLens e SE2 per ingrandimenti superiori o inferiori, rispettivamente. I parametri di scansione erano i seguenti: tensione di accelerazione, 3,5 kV; corrente della sonda, 36 pA; e pressione nella camera, ~ 7 × 10-5 Pa.
Le immagini EDX sono state catturate con lo strumento Zeiss Ultra Plus. Le mappe a raggi X e gli spettri sono stati presi da un rivelatore a raggi X X-MaxN 80 (Oxford Instruments, UK). I parametri EDX erano i seguenti: tensione di accelerazione, 10 kV; corrente della sonda, 300 pA; distanza di lavoro, 8,5 mm; e tempo di processo, 4 .
Attività ossidativa diretta delle medicazioni
La generazione di ROS in condizioni di assenza di cellule è stata valutata utilizzando 3,3′,5,5′-tetrametil-benzidina (TMB) come substrato per la perossidasi di rafano (HRP). Cerchi di diametro 6 mm sono stati tagliati dalle medicazioni e testati. In breve, la soluzione di lavoro era costituita da 0,1 mg/ml di TMB (soluzione madre c = 1 mg/mL in DMSO) miscelata 1:9 con tampone citrato–fosfato da 0,05 M (pH = 5) e HRP (c finale = 0,16 UI/mL). Ogni pezzo di medicazione è stato immerso in 0,5 ml della soluzione di lavoro e i campioni (25 µL) sono stati raccolti a 0, 5, 7,5 e 10 min. Immediatamente dopo la raccolta, i campioni sono stati miscelati nel rapporto di 1:1 con 0,16 M H2SO4 e l’assorbanza è stata letta a 450 nm (lunghezza d’onda di riferimento = 540 nm) utilizzando uno strumento NanoDrop OneC (ThermoFisher Scientific, US). Il 30% di H2O2 è stato utilizzato come controllo positivo. Il segnale di fondo (soluzione vuota) è stato sottratto.
Penetrazione dell’argento nella pelle deepitelizzata
Abbiamo usato le cellule di Franz a diffusione statica per studiare la penetrazione dell’argento nella pelle deepitelizzata. La pelle è stata ottenuta da un macello locale (Bocus, Letohrad, Repubblica Ceca) ed asportata dalla parte interna del padiglione auricolare porcino. I capelli sono stati rasati, la pelle è stata incubata in PBS (60 °C, 90 s) e l’epidermide è stata staccata. Lo spessore medio della pelle deepitelizzata era di 2 mm. I pezzi di pelle sono stati posti in una camera e coperti con una medicazione d’argento testata o un pezzo di garza. Ogni camera donatrice è stata riempita con 0,3 ml di terreno di coltura NHDF con 10% FBS. La camera di accettore conteneva 0,7 ml di terreno di coltura. Le cellule di diffusione sono state incubate a 37 °C per 24 o 48 h. Dopo l’incubazione, la pelle è stata risciacquata con PBS e le parti della pelle che separavano le camere donatore e accettore sono state analizzate per il contenuto di argento utilizzando ICP-OES, come descritto sopra. La quantità di argento che penetrava attraverso la pelle deepitelizzata è stata misurata nel fluido donatore. Tre repliche indipendenti sono state preparate in entrambi i momenti.
Coltivazione della pelle ex vivo con medicazioni
I padiglioni auricolari porcini freschi (1-2 h) (Bocus) sono stati accuratamente puliti con sapone e Betadine (una soluzione di iodio PVP, Egis Pharma, Ungheria) e risciacquati con acqua. I pezzi di pelle (1 × 1 cm) dai padiglioni auricolari sono stati asportati e posti in soluzione antibiotica (soluzione di penicillina–streptomicina, 10.000 U/mL penicillina, 10 mg/mL streptomicina) per 30 min a 37 °C sotto O2 atmosferico e CO2. Campioni di pelle con epidermide intatta sono stati posti sul lato dermico verso l’alto in piastre di coltivazione a 6 pozzetti con 3 ml di mezzo NHDF integrato con 10% FBS e quindi coperti con 1 × 1 cm di medicazione contenente argento selezionata o garza di controllo sterile imbevuta di 300 µl di terreno di coltivazione. I campioni sono stati incubati per 24 o 48 h. Successivamente, la pelle è stata risciacquata con PBS e ciascuno degli espianti cutanei è stato diviso in terzi per l’esame istologico (fissazione del 4% PFA a 4 °C), l’analisi delle proteine mediante Western blot (congelamento a scatto con azoto liquido) e qPCR (durante la notte in RNAlater (Thermo Fisher Scientific), quindi a − 80 °C).
Colorazione istologica
La colorazione autometallografica dell’argento è stata adottata secondo Danscher et al.49. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio Eclipse 50i con una fotocamera DS-Fi1 collegata (Nikon, Yokohama-Shi, Giappone).
Per l’immunofluorescenza di yH2AX, sezioni istologiche su vetrini Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) sono state deparaffinizzate e incubate durante la notte con anticorpi primari (1:1.000, ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, clone JBW301, Millipore, MA, USA). Sono stati quindi incubati per 1 ora con un anticorpo secondario (ab150114, Abcam, Cambridge, UK; diluizione 1: 10 000) e montati su vetrini con ProLong Diamond Antifade Mountant con DAPI (ThermoFisher Scientific). Le immagini sono state catturate con un microscopio fluorescente Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Giappone).
Espressione genica
La pelle suina dopo incubazione con medicazioni è stata elaborata per l’isolamento dell’RNA, la sintesi del cDNA e l’espressione genica qPCR come descritto in precedenza da Klein et al.50 Saggi di PCR in tempo reale TaqMan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) utilizzati per qPCR sono stati: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. I valori del ciclo soglia sono stati normalizzati con il gene di pulizia RPL13A e correlati a campioni di controllo di garza per il tempo particolare (intervallo di 24 o 48 ore) utilizzando il metodo 2 – δδct51. Sono stati misurati e mediati sei campioni indipendenti per ogni trattamento e tempo. Il significato delle differenze nell’espressione genica rispetto al controllo della garza è stato valutato utilizzando il t-test dello studente per ogni medicazione d’argento nel tempo specificato.
Western blotting
Per la successiva analisi di Western blot, sono stati preparati lisati tissutali da pelle suina congelata. Utilizzando un bisturi in una goccia di tampone di lisi (50 mM Tris pH 8; 150 mm NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% sodio desossicolato; 1% sodio dodecil solfato; 4% urea), la pelle è stata tagliata in piccoli pezzi, che sono stati successivamente omogeneizzati in 350 µl del tampone di lisi utilizzando un cordone di acciaio inossidabile 5 mm e un omogeneizzatore di tessuto (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Germania) per 10 min a 25 Hz. La concentrazione di proteine è stata misurata mediante il BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific).
Le proteine contenute nei lisati sono state separate utilizzando il gradiente SDS-PAGE del 4-15% e trasferite su membrane di difluoruro di polivinilidene. Per rilevare proteine specifiche, le membrane sono state incubate durante la notte in un tampone bloccante (20 mm Tris; 137 mm NaCl; 0,05% Tween 20; 5% di latte in polvere a basso contenuto di grassi essiccato) con l’anticorpo primario fosfo-istone H2A.X (20E3) (1:1.000; Segnalazione cellulare, USA). la β-actina è stata utilizzata come controllo del carico della quantità di proteine (1: 2000; Santa Cruz, USA). Le membrane sono state sviluppate con Ig anti-coniglio o anti-topo coniugato con HRP utilizzando il rilevamento chemiluminescente per visualizzare i segnali (Clarity Western ECL substrate; Bio-Rad, US). I segnali sono stati scansionati e valutati con un sistema di imaging a chemiluminescenza Alliance 9.7 Chroma (UVItec Limited, UK).
Attività antibatterica
Il metodo di diffusione dell’agar è stato utilizzato per confrontare le attività antimicrobiche delle medicazioni. Un campione (1 cm2) di ogni medicazione è stato incubato su una capsula di Petri appena inoculata con Staphylococcus aureus o Pseudomonas aeruginosa; questi ceppi sono stati isolati da ferite croniche umane, caratterizzati e coltivati come descritto in precedenza52. Inoltre, l’efficacia antimicrobica degli estratti di medicazione (preparati in mezzo RPMI con 10% FBS, come descritto sopra) è stata confrontata mediante il metodo di microdiluizione53. La densità ottica è stata misurata da un lettore di piastre multimodali Ensight (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) a 600 nm per 24 h (agitazione, 37 °C).
Coltura cellulare
Fibroblasti dermici umani normali da pelle adulta (NHDF) sono stati acquistati da Lonza (Basilea, Svizzera). NHDF sono stati coltivati in Aquile modificate di Dulbecco low glucose medium (DMEM) integrato con 10% FBS, glutammina (0,3 mg/mL), glucosio (4 mg/mL), penicillina (100 unità/mL) e streptomicina (0,1 mg/mL) in flaconi di coltura di 75 cm2 sotto il 5% di CO2 e a 37 °C fino al quinto passaggio. I cheratinociti di HaCaT sono stati acquistati da Hölzel Diagnostika (Köln, Germania) e sono stati coltivati allo stesso modo ma senza l’aggiunta di glucosio al terreno.
Misurazione della vitalità
Cinquemila cellule per pozzetto sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti con 200 µL del terreno di coltura con 10% FBS in un incubatore (37 °C, 5% CO2) durante la notte. Il giorno seguente, le cellule sono state trattate con 200 µL di una serie di diluizioni di estratti dalle medicazioni (100%, 50%, 20%, o 10% dell’estratto originale diluito con terreno di coltura integrato con 10% FBS) per 24, 48 e 72 h. Le cellule di controllo sono state trattate con un terreno di coltura standard 10% FBS. La vitalità è stata misurata come descritto in precedenza54 utilizzando il saggio 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio bromuro (MTT). La soluzione madre MTT (20 µL; c = 5 mg/mL) è stata aggiunta al mezzo di coltura cellulare in ciascun pozzetto. Le piastre sono state incubate per 2,5 ore a 37 °C. Quindi, la soluzione MTT è stata rimossa, sono stati aggiunti 220 µL di soluzione di lisi (1:1 propan-2-ol con DMSO, 10% (p/v) Triton X-100 e 0,37% (p/v) HCl) e la lisi è stata effettuata per 30 min a temperatura ambiente su uno shaker rotante (150 rpm). L’assorbanza è stata letta a 570 e 690 nm con un lettore di piastre multimodali EnSight (PerkinElmer, USA). I dati sono stati elaborati a Kaleido (PerkinElmer, USA). L’assorbanza finale è stata calcolata come A = A570-A690. La variazione della vitalità delle cellule trattate rispetto alle cellule di controllo è stata calcolata come cambiamento = (Un campione/Un controllo – 1) × 100.
Test di inibizione a contatto diretto
Le cellule sono state seminate ad una densità di 300 000 cellule per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti e incubate nel mezzo di coltura integrato con 10% di FBS a 37 °C e sotto il 5% di CO2 fino al raggiungimento della confluenza. Le medicazioni sono state tagliate in quadrati di 1 cm2, posizionate sullo strato cellulare e incubate con il mezzo di coltura standard per 6 h. Le cellule di controllo sono state trattate solo con il mezzo. Successivamente, le cellule sono state lavate con PBS e fissate con 4% paraformaldeide per 15 min. Le cellule sono state colorate con una soluzione di cristallo viola allo 0,1% (p/v) (sciolta in etanolo al 10%) per un’ora e poi risciacquate con acqua. Le zone di inibizione sono state fotografate utilizzando una fotocamera digitale Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f (Canon).
Colorazione fluorescente delle cellule
Per l’analisi del danno al DNA, le cellule NHDF sono state seminate su vetrini microscopici in una piastra a 6 pozzetti ad una densità 2 × 105 per pozzetto e lasciate aderire durante la notte. Il giorno seguente, le cellule sono state trattate con 5 × estratti di medicazione diluiti e incubate per 24 h. Successivamente, le cellule sono state fissate usando 4% PFA per 15 min. Dopo permeabilizzazione e blocco, i vetrini sono stati incubati con un anticorpo primario di coniglio anti-yH2AX (Segnalazione cellulare, US; diluizione 1:500 in un tampone di blocco—20% FBS, 0,3 M glicina, 0,05% Tween 20 in PBS; durante la notte; 4 °C). Il rilevamento è stato effettuato utilizzando un anticorpo secondario marcato con Alexa Fluor 555 (Abcam, UK; 1:500 in un tampone bloccante; 1 h, RT). I vetrini sono stati montati utilizzando ProLong Diamond Antifade Mountant con DAPI (ThermoFisher Scientific). Dopo che le diapositive sono state asciugate, le immagini sono state scattate utilizzando un microscopio fluorescente Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Giappone).
Lo stress ossidativo intracellulare è stato rilevato utilizzando una sonda DCF-DA, che è sensibile alla concentrazione complessiva di ROS all’interno delle cellule. Le cellule sono state seminate durante la notte in una piastra da 24 pozzetti e poi etichettate con DCF-DA (1 µg/mL) per 15 min, dopo di che sono state trattate con 5 × estratti di medicazione diluiti e incubate a 37 °C e sotto il 5% di CO2. 5 mM H2O2 è stato utilizzato come controllo positivo. La fluorescenza verde del DCF è stata registrata ogni 15 minuti durante un periodo di incubazione di 90 minuti utilizzando un microscopio automatico Incucyte S3 (Essen Bioscience, USA). La quantificazione della fluorescenza intracellulare è stata eseguita nel software Fiji seguendo il metodo descritto da Čepa55.
Determinazione del burst ossidativo da parte dei neutrofili nel sangue intero
Un comitato etico indipendente ha approvato la raccolta di campioni di sangue per il test burst ossidativo dei neutrofili e MAT (Comitato etico per la ricerca presso l’Università Masaryk, Brno, Repubblica Ceca, approvazione n. EKV-2018-083). Tutti i donatori hanno dato il loro consenso scritto.
Lo scoppio ossidativo (produzione ROS) dei fagociti del sangue è stato determinato in sangue intero diluito mediante chemiluminescenza potenziata con luminol (CL) utilizzando un luminometro micropiastra LM-01T (Immunotech, Repubblica Ceca). In breve, la miscela di reazione consisteva in 6 µL di sangue intero in 54 µl di terreno di crescita RPMI-1640 mescolato con 60 µl di estratto di medicazione in soluzione salina fisiologica o un mezzo integrato da FBS. Questa miscela è stata incubata a 37 °C per 20 min. Poco prima dell’inizio della misurazione, abbiamo aggiunto 1 mm di luminol (una soluzione madre di 10 mm di luminol in un tampone di borato da 0,2 M) (Molecular Probes, USA). Abbiamo determinato la produzione spontanea di ROS e la produzione di ROS indotta da particelle opsonizzate di zymosan (OZP-0.1 mg / mL) (Sigma-Aldrich, USA) o phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA-0.8 µM; Sigma-Aldrich, USA). I campioni non trattati senza gli estratti testati sono stati valutati come controlli. I test sono stati eseguiti in duplicati. La chemiluminescenza è stata registrata continuamente per 90 min a 37 °C ed è stata espressa come unità di luce relativa (RLU). Abbiamo determinato la quantità totale di produzione di ROS dall’area integrata sotto la curva di chemiluminescenza.
Test di attivazione monocitaria (MAT)
MAT è stato eseguito in sangue intero umano eparinizzato diluito con soluzione salina 10×. Campioni di sangue sono stati raccolti da cinque donatori sani, raggruppati e diluiti con soluzione salina. I campioni di sangue diluiti sono stati incubati con cerchi di diametro 6 mm tagliati da medicazioni in microtubi sterili per 24 h a 37 °C. In parallelo, lipopolisaccaride (LPS, finale c = 0. 25 UI/mL; Endotossina Standard E-Toxate; Sigma, US) è stato aggiunto alla seconda serie di campioni incubati con campioni di medicazione per stimolare una risposta immunitaria innata ai batteri. Le cellule del sangue sedimentate durante l’incubazione, lasciando una fase superiore di plasma diluito con soluzione salina. Dopo l’incubazione, 200 µL di ciascun campione di plasma diluito con soluzione salina sono stati raccolti e immediatamente analizzati in duplicati per IL-6 utilizzando un kit ELISA umano non rivestito IL-6 secondo il protocollo del produttore (ThermoFisher Scientific, US). L’assorbanza è stata letta utilizzando un lettore di piastre multimodali EnSight (PerkinElmer, US) e la concentrazione finale di IL-6 è stata calcolata da Kaleido SW (Perkin Elmer, US). Il plasma rimanente e le cellule sedimentate sono state conservate a 4 °C per la valutazione dell’emolisi e della tossicità.
Emolisi
L’emolisi è stata rilevata nel plasma diluito con soluzione salina rimanente e nelle cellule sedimentate da MAT. Dopo la centrifugazione, 100 µL di ciascun campione sono stati trasferiti su una micropiastra a 96 pozzetti e l’assorbanza è stata misurata a 550 nm. 1% Triton X-100 è stato utilizzato come controllo positivo.
Rilascio di LDH
Le tossicità delle medicazioni in argento per le cellule del sangue sono state valutate mediante il test della lattato deidrogenasi (LDH) (Cytotoxicity Detection KitPLUS, Roche, Svizzera) secondo le istruzioni del produttore. Sono state utilizzate due fonti di cellule del sangue: sangue intero umano incubato con medicazioni d’argento come in MAT e neutrofili isolati. L’assorbanza utilizzata per la correzione del fondo è stata misurata in campioni vuoti senza il reagente LDH. I risultati sono riportati come valori assoluti di densità ottica rispetto a un campione non trattato.
Analisi statistica
Se non diversamente indicato, il t-test dello studente è stato utilizzato per valutare la significatività statistica delle differenze tra campioni e controlli non trattati.