Introduzione
Kcat è il numero di fatturato-il numero di molecole substrato ogni sito enzimatico converte in prodotto per unità di tempo. Se si conosce la concentrazione dei siti enzimatici, è possibile adattare Kcat anziché Vmax quando si analizza un substrato rispetto alla curva di velocità.
Il modello
Y = Et*kcat*X/(Km + X)
X è la concentrazione del substrato.
Y è la velocità degli enzimi.
kcat è il numero di fatturato, il numero di volte in cui ogni sito enzimatico converte il substrato in prodotto per unità di tempo. Questo è espresso nell’inverso delle unità di tempo dell’asse Y. Ad esempio, se Y è in micromoli di substrato al minuto, allora kcat è il numero di molecole di substrato prodotte per sito catalitico al minuto.
Km è la costante di Michaelis-Menten, nelle stesse unità di X. È la concentrazione del substrato necessaria per ottenere una velocità enzimatica mezzo-massima.
Et è la concentrazione dei siti catalitici enzimatici. Se l’enzima ha più subunità, si noti che Et è la concentrazione dei siti catalitici, che può essere maggiore della concentrazione delle molecole enzimatiche. I valori Y immessi sono velocità enzimatica immessa in unità di concentrazione per tempo. Et deve essere inserito in quelle stesse unità di concentrazione (mentre le unità di tempo sono definite da kcat).
Vmax è la velocità massima dell’enzima nelle stesse unità di Y. Non è mostrato direttamente nel modello sopra. È la velocità dell’enzima estrapolata a concentrazioni molto elevate di substrato, quindi è quasi sempre superiore a qualsiasi velocità misurata nel tuo esperimento. È calcolato moltiplicando Et volte kcat.
Relazione con il modello Michaelis-Menten
La curva mostrata sopra è identica alla curva definita dal modello Michaelis-Menten. Otterrete curve identiche quando si adatta entrambi i modelli ai dati e valori identici per Km.
Il modello di Michaelis-Menten trova il Vmax, che è la massima velocità enzimatica estrapolata a concentrazioni molto elevate di substrato. È espresso nelle stesse unità utilizzate per immettere i valori Y (attività enzimatica). Di solito è semplice esprimere questo (o convertire in ) talpe / minuto / mg di proteine. Il Vmax è determinato dal numero di siti enzimatici presenti (Et) e dalla velocità con cui l’enzima può convertire il substrato in prodotto (kcat).
Se conosci la concentrazione dei siti enzimatici che hai aggiunto al test (Et), puoi adattare la costante catalitica Kcat usando il modello sopra.
Quando si calcola Kcat, le unità di concentrazione si annullano, quindi Kcat è espresso in unità di tempo inverso. È il numero di fatturato – il numero di molecole di substrato che ogni sito enzimatico converte in prodotto per unità di tempo.
Montaggio del modello con prisma
1.Creare una tabella dati XY. Inserisci la concentrazione del substrato in X e la velocità dell’enzima in Y. Se hai diverse condizioni sperimentali, posiziona il primo nella colonna A, il secondo nella colonna B, ecc. Puoi anche scegliere i dati di esempio di Prism: Enzyme kinetics — Michaelis-Menten.
2.Dopo aver inserito i dati, fare clic su Analizza, scegliere regressione non lineare, scegliere il pannello di equazioni cinetiche enzimatiche e scegliere Kcat.
3.È necessario vincolare Et a un valore costante, sulla base di altri esperimenti. Per vincolare il valore di Et, vai alla scheda Vincola della finestra di dialogo regressione non lineare, assicurati che il menu a discesa accanto a Et sia impostato su “Costante uguale a” e inserisci il valore. Per i dati di esempio, immettere 100 come valore di Et.
Se non si conosce il valore di Et, non è possibile adattare kcat, ma invece dovrebbe adattarsi al Vmax. Non è possibile per Prism adattarsi sia al kcat che all’Et, poiché i due parametri sono intrecciati e una curva di velocità del substrato non fornisce informazioni sui loro valori individuali.
4.Con i dati di esempio, Prism riporta che Km= 5.886 con un intervallo di confidenza del 95% compreso tra 3.933 e 7.839. Il miglior valore di adattamento di kcat è 13,53 con un intervallo di confidenza del 95% compreso tra 11,97 e 15,09.
Note
•Vedere l’elenco delle ipotesi di tutte le analisi della cinetica enzimatica.
•Questa equazione si adatta esattamente alla stessa curva dell’equazione che si adatta a Vmax, piuttosto che al numero di turnover Kcat. Il prodotto di Kcat times Et (la concentrazione dei siti enzimatici) è uguale al Vmax.
•Questa equazione è correlata all’equazione per gli enzimi allosterici. Quel modello allosterico aggiunge un parametro aggiuntivo: la pendenza della collina h. Quando h è uguale a 1.0, i due modelli sono identici.