Identificazione di Bordetella pertussis in una fase critica di malattia da Virus dell’Immunodeficienza Umana-Paziente Infetto Diretta Analisi Genotipica di batteri Gram-Colorato Materiale e la Discriminazione da B. holmesii utilizzando un unico sito enzimatico di restrizione del gene recA

L’identificazione dei batteri dai campioni clinici è in gran parte fatta via la caratterizzazione fenotipica dopo la coltura in vitro e la microscopia. Non di rado, tuttavia, i preparati diretti macchiati di gram rivelano molti organismi, ma le culture non riescono a dimostrare un agente patogeno. Questo è stato illustrato in un recente caso clinico, in cui un uomo di 48 anni con AIDS è stato ricoverato con coccidioidomicosi polmonare. Nonostante la terapia antifungina, il suo stato non è riuscito a migliorare. I campioni di espettorato hanno rivelato molti bacilli gram-negativi sulla microscopia diretta ma nessun patogeno sulla coltura. Inoltre, diverse emocolture crescevano fastidiose barre gram-negative, che non potevano essere speciate con metodi convenzionali.

Abbiamo deciso di tentare l’identificazione dei due isolati con metodi genotipici utilizzando primer oligonucleotidici universali mirati alla piccola subunità rRNA (16S rRNA) gene. Dai campioni respiratori, tuttavia, erano disponibili solo vetrini macchiati di gram. Abbiamo quindi sviluppato un nuovo metodo, in cui il DNA batterico viene recuperato direttamente dal vetrino macchiato di Gram. Le diapositive sono state macchiate con la metodologia tradizionale (12). Un vetrino trasparente è stato imbrattato con campioni e trattato con metanolo assoluto (Mallinckrodt, Hazelwood, Mo.), seguita da fissazione del calore a 65°C e trattamento con soluzione crystal violet (Remel, Lenexa, Kans.). Il vetrino è stato ulteriormente trattato con iodio di Gram (Remel), decolorato con soluzione di alcool-acetone (3:1) e contrastato con safranina (Remel). L’olio per immersione è stato prima rimosso dal vetrino con xilene al 100% (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) seguito da risciacquo in etanolo al 100%. Quindi il materiale è stato rottamato con una lama di rasoio diritta, sospesa in 50 µl di soluzione di idratazione Puregene-DNA (Gentra, Minneapolis, Minn.), vortexato e bollito per 10 min. Per l’analisi del sangue isolato, è stato utilizzato materiale sia dalla bottiglia di BACTEC che da colonie coltivate su terreno solido. La successiva PCR è stata eseguita in un volume di 50 µl contenente 5 µl del modello, 1,5 mm MgCl2, 100 µM ciascuno deossinucleoside trifosfato (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind.), 1 U di Taq DNA polimerasi (Roche Diagnostics Corporation) e 0,15 µM (ciascuno) primer universali 16S rRNA 11E (5′-GAGGAAGGTGGGGATGACG-3′) e 13B (5′-TCCGGGCCTTGCATAAGTG-3′) come descritto in precedenza (15). Dopo una fase di denaturazione di 5 min a 94°C, passi PCR di 94 ° C per 60 s, 50°C per 60 s e 72°C per 90 s sono stati ripetuti 30 volte in un sistema PCR GeneAmp Perkin-Elmer 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.). I prodotti sono stati ottenuti sia dall’espettorato che dal sangue (Fig. 1). Questi sono stati purificati con il kit di purificazione QIAquick PCR (Qiagen Inc., Valencia, California.), e il sequenziamento del DNA è stato eseguito su un sequencer applicato Biosystems ABI3100 (HHMI Biopolymer / W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University School of Medicine). Il successivo confronto con il database pubblico (GenBank) di BLAST (1) ha identificato l’isolato di sangue come Helicobacter cinaedi o Helicobacter rappini. Entrambi gli organismi sono stati associati a batteriemie in pazienti immunocompromessi(9, 10, 13, 16, 17). Il prodotto PCR dell’isolato respiratorio corrispondeva ai geni rRNA 16S di Bordetella pertussis e Bordetella holmesii, che sono omologhi al 99,5% e identici nella regione amplificata (18).

Al fine di speciare l’isolato respiratorio di Bordetella e convalidare il risultato dell’analisi genotipica, è stato sviluppato un test discriminatorio in cui è stata mirata una porzione del gene recA (6, 7), che contiene un sito enzimatico di restrizione unico. Amplificazione di B. pertussis (ATCC 9340; American Type Culture Collection, Manassas, Va.) e B. holmesii (ATCC 51541) DNA così come quello dalla colorazione Gram espettorato del nostro paziente è stata effettuata come descritto sopra, tranne che 3 mm MgCl2 e primer specifici di nuova concezione (avanti, 5 ‘- CAATACGCCTCCAAGCTGGG-3′; e viceversa, 5′-TGATGTCGAACTCGGCCTGC-3’), e le fasi di PCR (94°C per 30 s, 59°C per 30 s e 72°C per 60 s) sono state ripetute 45 volte seguite da una fase di allungamento finale a 72 ° C. I prodotti sono stati digeriti con NciI secondo le raccomandazioni del produttore (New England Biolabs, Inc. Beverly, Messa.). I due organismi potrebbero essere facilmente distinti perché B. holmesii ha due siti NciI, mentre B. pertussis e tutti gli altri Bordetella spp. avere solo un sito NciI all’interno della regione amplificata. L’isolato dell’espettorato è stato successivamente identificato come B. pertussis (Fig. 2) ed è stato segnalato come patogeno polmonare opportunistico in pazienti con infezione da virus dell’immunodeficienza umana (4, 5).

Abbiamo quindi studiato se l’identificazione genotipica degli organismi direttamente dai preparati clinici di colorazione di gram con primer universali sia un metodo fattibile e riproducibile. Il tipo di fissazione (calore, 100% metanolo e 100% etanolo) e la presenza di residui di colorante dopo la colorazione di Gram come descritto sopra non interferiscono con la PCR. È stato trovato un limite di rilevazione di 1.500 CFU/µl di espettorato (da 6 a 30 organismi per campo di immersione in olio), che è simile ad altri rapporti (14). Per questo risultato, tre campioni clinici casuali di espettorato senza batteri sulla macchia di gram o in coltura sono stati raggruppati, appuntiti con quantità definite di Escherichia coli (ATCC 25922), fissi e macchiati di gram e raschiati dal vetrino come descritto sopra. Sono stati testati diversi campioni clinici scelti a caso e, quando un organismo predominante era visibile al microscopio, la sua identificazione corrispondeva al patogeno coltivato (Tabella 1).

Il nostro metodo presenta diversi vantaggi rispetto ai test descritti in precedenza. A differenza dei rapporti precedenti, in cui il DNA viene prima estratto dall’espettorato e vengono utilizzati primer specifici per specie(2, 11, 14, 19, 20), il nostro test utilizza DNA recuperato direttamente da vetrini macchiati di gram senza fasi di estrazione e utilizza primer universali, consentendo così l’identificazione di una vasta gamma di batteri con un semplice protocollo. Come mostrato, questo può essere ottenuto anche in presenza di normale flora residente di fondo perché il numero di cicli di PCR è limitato, consentendo così un’amplificazione competitiva del DNA batterico. Poiché la qualità del campione presentato e le proporzioni relative dei microbi morfologicamente differenti possono essere determinate facilmente sulle macchie di grammo, gli strisci adatti possono essere selezionati prima dell’amplificazione del DNA. Inoltre, l’aspetto della macchia di gram dell’organismo predominante funge da controllo di qualità interno dopo l’identificazione genotipica. Come per l’identificazione fenotipica, i risultati del nostro test devono essere correlati con il quadro clinico prima che vengano prese decisioni di trattamento, poiché nessuno dei due metodi può distinguere in modo affidabile tra colonizzazione e infezione.

Tra i pochi rapporti nella letteratura in lingua inglese che descrivono il recupero di acido nucleico da campioni clinici su vetrini (3, 8), nessuno finora ha descritto l’amplificazione del DNA dopo il recupero di batteri da vetrini macchiati di gram. Il nostro metodo è veloce e affidabile e può essere utilizzato come strumento nei casi in cui gli organismi sono visti in abbondanza su vetrini clinici macchiati di gram, ma non possono essere recuperati in coltura. La tecnica può essere particolarmente utile quando si cerca una diagnosi retrospettivamente o dopo che i campioni originali sono stati scartati.