Una pietra miliare significativa nella scienza riproduttiva è stata raggiunta con la nascita del topo ‘Kaguya’, il primo mammifero partenogenetico vitale (Kono et al. 2004). Il lavoro è stato svolto dal dottor Tomohiro Kono e colleghi, e rappresenta un importante risultato tecnico che coinvolge la produzione di molte centinaia di uova ricostruite, da cui dieci vivi, e diciotto morti, cuccioli sono stati ottenuti al giorno 19.5 di gestazione. Dei due cuccioli sopravvissuti, uno è stato ucciso per studi di espressione genica e l’altro, Kaguya, è stato favorito e sopravvissuto per riprodursi con successo con mezzi convenzionali. Questo lavoro espande ulteriormente ciò che è realizzabile nella riproduzione artificiale e può avere importanti implicazioni per la comprensione degli aspetti dello sviluppo embrionale e della regolazione genica. Tuttavia, contrariamente alle opinioni di alcuni commentatori della stampa popolare, è improbabile che abbia un impatto importante sulle tecnologie riproduttive artificiali umane.
L’imprinting genomico, l’espressione differenziale dei geni a seconda della loro origine genitoriale, è la principale (forse l’unica) barriera allo sviluppo partenogenetico nei mammiferi, in cui l’individuo non contiene materiale genetico paterno. In termini meccanicistici, l’imprinting genomico significa che la cromatina di alcuni loci genetici è modificata in modo differenziale nelle linee germinali parentali in modo che gli alleli parentali siano espressi in modo differenziale nell’embrione in via di sviluppo. Circa cinquanta geni sono stati descritti nei topi e negli esseri umani che mostrano il silenziamento trascrizionale di uno degli alleli parentali durante lo sviluppo embrionale (Moore et al. 2001, Fig. 1 BIS). Gli embrioni partenogenetici sono quindi carenti di prodotti genici impressi paternalmente espressi e presentano un grave ritardo della crescita e la morte intrauterina.
Per quasi un decennio, Kono e altri hanno lavorato per migliorare la misura in cui gli embrioni partenogenetici possono svilupparsi in utero, rivelando così importanti dettagli meccanicistici del processo di imprinting (Kono et al. 1996, 2002, Obata et al. 1998, Kato et al. 1999, Bao et al. 2000, 2003, Sotomaru et al. 2002). Principalmente, il loro lavoro mostra che l’imposizione di impronte nella linea germinale materna avviene in una fase relativamente tarda dell’oogenesi. Pertanto, in alcuni loci genetici impressi, gli ovociti non in crescita (ng) possono essere “imprint-neutral” rispetto alle impronte imposte dalla madre, o possono conservare alcune impronte paterne che non vengono rimosse fino a tardi nell’oogenesi. Ci sono prove per entrambe queste possibilità (Kono et al. 1996, Obata et al. 1998, Kato et al. 1999, Bao et al. 2000, T Kono, osservazioni inedite). Quando si utilizzano ovociti ng per ricostituire la diploidia di uova non fecondate (Fig. 1B), il risultato è uno sviluppo ben al di là di ciò che normalmente si vede usando ovociti completamente cresciuti (fg). Tuttavia, nonostante questi miglioramenti, il più lontano che tali embrioni possano svilupparsi è al giorno 13.5 della gestazione (Kono et al. 1996). L’analisi genetica molecolare di questi embrioni indica che, mentre diversi geni impressi espressi paternalmente sono espressi dal genoma dell’ovocita ng, il gene H19 espresso normalmente materno è espresso biallelicamente e il gene Igf2 espresso paternalmente è silenziato su entrambi gli alleli derivati da ng e fg (Obata et al. 1998).
Il passo successivo di Kono è stato quello di tentare di correggere il dosaggio del gene H19 e Igf2 negli embrioni partenogenetici introducendo cromosomi contenenti delezioni che: (i) abolire la trascrizione H19 (Kono et al. 2002, Fig. 1C), e (ii) abolire la trascrizione H19 e recuperare l’espressione Igf2 (Kono et al. 2004, Fig. 1D). La prima manipolazione ha esteso lo sviluppo partenogenetico in utero al giorno 17.5 della gestazione e il secondo ha portato alla nascita di Kaguya. Presi al valore nominale, questi risultati implicano che ulteriori miglioramenti nel tasso di successo dello sviluppo partenogenetico sono possibili con una conoscenza più approfondita del processo di imprinting e manipolazioni più sofisticate del genotipo o dell’epigenotipo. In sostanza, un tipo di ingegneria dello sviluppo razionale può essere realizzabile.
Tuttavia, Rudolf Jaenisch, citato di recente in The Scientist, sostiene che Kaguya è semplicemente un evento stocastico, in cui una componente importante della base epigenetica della sua vitalità è imprevedibile (Holding et al. 2004). Egli relega essenzialmente logica di Kono di utilizzare H19 / Igf2 transgenici ad un ruolo minore. Implicitamente, sostiene che se viene eseguito un gran numero di esperimenti di ricostituzione embrionale, la nascita di una progenie vitale può verificarsi a causa del campionamento casuale dello “spazio epigenotipo”. I suoi argomenti sono paralleli al suggerimento che gli animali clonati vitali prodotti dalla riprogrammazione delle cellule somatiche siano solo eventi unici e casuali (Surani 2003). Tuttavia, negli esperimenti di Kono, in contrasto con la clonazione delle cellule somatiche, il nucleo dell’ovocita ng probabilmente non subisce un’ampia riprogrammazione della cromatina, essendo già impegnato in un destino di cellule staminali germinali. Inoltre, tali ovociti vengono espiantati in una fase di sviluppo definita e quindi ci si aspetta che siano relativamente omogenei rispetto all’epigenotipo. Un confronto più istruttivo, negli esperimenti di ricostituzione embrionale, può essere con l’uso di nuclei spermatici aploidi dal testicolo o nuclei blastomerici diploidi da embrioni preimpianto, che subiscono tassi di sviluppo relativamente elevati.
Che cosa sta alla base dei bassi tassi di vitalità partenogenetica negli esperimenti di Kono? Una possibilità è che l’origine della variabilità dell’epigenotipo dell’ovocita ng sia dovuta al campionamento casuale di diverse combinazioni di regioni cromosomiche impresse di origine materna e paterna alla meiosi. Ricordiamo che il nucleo diploide dell’ovocita ng contiene omologhi di origine materna e paterna che possono differire sistematicamente (piuttosto che stocasticamente) nei loci impressi a causa della rimozione incompleta delle impronte materne e paterne residue in questa fase dello sviluppo dell’ovocita. In ogni locus impresso, gli omologhi di origine materna e paterna vengono mischiati e separati casualmente alla meiosi. Pertanto, negli esperimenti di Kono, ogni nucleo di ovocita ng aploide risultante rappresenta una delle 2n combinazioni di impronte materne e paterne, dove n è il numero di regioni cromosomiche impresse che rimangono differenzialmente modificate negli ovociti ng. Ad esempio, se il genoma diploide dell’ovocita ng contiene otto regioni cromosomiche impresse che presentano sistematicamente differenze residue tra omologhi materni e paterni, ne consegue che ci sono 28 (256) possibili epigenotipi, di cui forse solo un piccolo numero consente la vitalità embrionale. Per estendere l’esempio: forse solo 1 su 256 di ovociti ng che ereditano un set completo di otto omologhi precedentemente paterni è in grado di supportare un buon sviluppo embrionale a causa della conservazione di alcune impronte paterne in questi loci. La validità di questa ipotesi potrebbe essere testata utilizzando ovociti ng da un ibrido F1 per identificare la distribuzione di omologhi grandmaternal e grandpaternal a loci impressi in embrioni ricostituiti che mostrano uno sviluppo eccezionale.
Jaenisch osserva inoltre che il salvataggio della vitalità embrionale partenogenetica mediante il miglioramento dell’espressione di Igf2 (viz Kaguya) è inaspettato perché Igf2 è dispendioso per la vitalità negli embrioni biparentali normali. Tuttavia, il contributo di Igf2 alla vitalità embrionale è stato testato solo in un numero molto limitato di background genetici. È abbastanza concepibile che alcuni degli embrioni partenogenetici di Kono, con un modello di espressione genica e epigenotipo diverso rispetto agli embrioni biparentali, beneficino della complementazione con Igf2. Tuttavia, l’affascinante enigma di Kono su come la normalizzazione di H19/Igf2 “abbia causato la modifica di una vasta gamma di geni” (Kono et al. 2004) può essere una falsa pista perché l’epigenotipo di un embrione partenogenetico che risponde alla normalizzazione H19/Igf2 può differire da uno che non lo fa. Il cambiamento percepito nell’espressione genica associato all’aggiunta della mutazione H19Δ13 può quindi riflettere la selezione di un epigenotipo preesistente che facilita il miglioramento mediato da Igf2 dello sviluppo partenogenetico, piuttosto che essere un risultato diretto dell’espressione Igf2 di per sé.
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Schema dell’epigenotipo a H19 / Igf2 gene locus associato a varie manipolazioni di cellule germinali di topo. A) Fertilizzazione normale. B) Ricostituzione embrionale con ovocita completamente coltivato e ovocita non in crescita (Kono et al. 1996). C) Ricostituzione embrionale con ovocita completamente cresciuto e ovocita non in crescita che trasporta la delezione dell’unità di trascrizione H19 (Kono et al. 2002). D) Ricostituzione dell’embrione con ovocita completamente cresciuto e ovocita non in crescita che trasporta un’ampia delezione della regione del gene H19, inclusa la regione/elemento limite differenzialmente metilato a monte (Kono et al. 2004). Barre verticali: barre rosse, unità di trascrizione del gene Igf2; barre verdi, regione/elemento di confine differenzialmente metilato a monte del promotore del gene H19; barre blu, unità di trascrizione del gene H19. I valori si riferiscono al giorno di gestazione (stadio di sviluppo) raggiunto a seguito di ogni tipo di manipolazione.
Citazione: Reproduction 128, 1; 10.1530 / rep. 1.00311
-
Bao S, Obata Y, Carroll J, Domeki I & Kono T 2000 Epigenetic modifications necessary for normal development are established during oocyte growth in mice. Biology of Reproduction 62 616–621.
- Search Google Scholar
- Export Citation
-
Bao S, Ushijima H, Hirose A, Aono F, Y Y& Kono T 2003 Sviluppo di ovociti bovini ricostruiti con un nucleo da ovociti in fase di crescita dopo fecondazione in vitro. Teriogenologia 59 1231-1239.
- Cerca Google Scholar
- Esporta citazione
-
Tenendo C 2004 1 ° mouse per partenogenesi? Singolo knockout gene in doppio ovocita materno risultati in topi vitali, ma qualche dubbio studio. Lo scienziato aprile 21, http://www.biomedcentral.com/news/20040421/01/.
-
Kato Y, Rideout WM III, Hilton K, Barton SC, Tsunoda Y & Surani MA 1999 Potenziale di sviluppo delle cellule germinali primordiali del topo. Sviluppo 126 1823-1832.
- Search Google Scholar
- Export Citation
-
Kono T, Obata Y, Yoshimzu T, Nakahara T & Carroll J 1996 Le modifiche epigenetiche durante la crescita degli ovociti sono correlate allo sviluppo partenogenetico esteso nel topo. Natura Genetica 13 91-94.
- Cerca Google Scholar
- Esporta citazione
-
Kono T, Sotomaru Y, Katsuzawa Y & Dandolo L 2002 Gli embrioni partenogenetici di topo con espressione monoallelica H19 possono svilupparsi fino al giorno 17.5 della gestazione. Biologia dello sviluppo 243 294-300.
- Cerca Google Scholar
- Esporta citazione
-
Kono T, Obata Y, Wu Q, Niwa K, Yam Y, Yamamoto Y, Park ES, Seo JS & Ogawa H 2004 Nascita di topi partenogenetici che possono svilupparsi fino all’età adulta. Natura 428 860-864.
- Search Google Scholar
- Export Citation
-
Moore T 2001 Conflitto genetico, imprinting genomico e definizione dell’epigenotipo in relazione alla crescita. Riproduzione 122 185-193.
- Ricerca su Google Scholar
- Esporta Citazione
-
Obata Y, Kaneko-Ishino T, Koide T, Takai Y, Ueda T, Domeki io, Shiroishi T, Ishino F & Kono T 1998 Interruzione di primaria imprinting, durante il lungo di crescita porta a modificato l’espressione di geni “imprinted” durante l’embriogenesi. Sviluppo 125 1553-1560.
- Cerca Google Scholar
- Esporta citazione
-
Sotomaru Y, Katsuzawa Y, Hatada I, Obata Y, Sasaki H & Kono T 2002 Espressione non regolamentata dei geni impressi H19 e Igf2r nei feti uniparentali del topo. Journal of Biological Chemistry 277 12474–12478.
- Search Google Scholar
- Export Citation
-
Surani A 2003 False impressions on human cloning. Reproductive BioMedicine Online 6 398–399. http://www.rbmonline.com/Article/942.
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