Questo rapporto descrive l’emergere di LBCL in un cane con TZL preesistente e persistente. Nell’oncologia umana, la presenza di due linfomi distinti, clonalmente non correlati, all’interno dello stesso organo è definita “linfoma composito”. Questa entità comprende < il 5% di tutti i linfomi nell’uomo , ma non è stata precedentemente riportata nei cani. La diagnosi di linfoma composito richiede una valutazione morfologica, immunoistochimica e molecolare . Nel caso riportato qui, questa diagnosi era basata sulle caratteristiche citomorfologiche e immunofenotipiche dissimili dei tumori e sulle due distinte firme clonali determinate dai test di clonalità basati su NGS. La trasformazione di neoplasie ematologiche indolenti in forme più aggressive, come la leucemia linfocitica cronica in linfoma di alto grado, è stata precedentemente riportata e sembra verificarsi occasionalmente nei cani . Tuttavia, in questo caso, l’evidenza combinata di molteplici modalità di test suggerisce fortemente la concomitanza di due linfomi distinti piuttosto che l’evoluzione di un linfoma indolente in una variante più aggressiva.
Differenziare la ricaduta dallo sviluppo di un tumore de novo è difficile per la maggior parte dei tipi di cancro. I tumori linfoidi differiscono in questo senso perché ogni clone linfocitario porta una sequenza di DNA unica che può essere utilizzata come impronta genetica per tracciare i cloni linfocitari nel tempo e attraverso i siti anatomici. Questa sequenza genica unica viene generata all’inizio dello sviluppo linfocitario mediante riarrangiamento dei geni del recettore dell’antigene e conferisce a ogni clone linfocitario una specificità antigenica unica. Il test di clonalità valuta la diversità dei geni del recettore dell’antigene linfocitario in una data popolazione linfocitaria. Nel campione iniziale, il test di clonalità ha confermato la diagnosi di TZL in base alla presenza di riarrangiamenti TRB e TRG clonali. Un singolo riarrangiamento produttivo del TRB e due riarrangiamenti improduttivi del TRG erano coerenti con un lignaggio delle cellule T alfa/beta del clone neoplastico, e l’uso di TRGV2/TRJ3–2 da parte di entrambi i cloni dominanti era indicativo di un riarrangiamento bi-allelico piuttosto che il riarrangiamento di due diverse cassette sullo stesso cromosoma. Gli stessi riarrangiamenti sono stati trovati nel secondo campione con abbondanza simile, il che suggerisce la persistenza del clone neoplastico delle cellule T a fronte del trattamento. Oltre ai riarrangiamenti clonali TRB e TRG, il secondo campione ha mostrato un clone IGH dominante che comprendeva circa l ‘ 88% di tutti i riarrangiamenti. Questo risultato non solo conferma la diagnosi di un linfoma a cellule B, ma suggerisce anche che il linfoma a cellule B è un tumore de novo piuttosto che una progressione del TZL con immunofenotipo alterato. In contrasto con l’espressione del marcatore della superficie cellulare, che può essere influenzata da stimoli micro-ambientali e dallo stadio di sviluppo e dalla vitalità di una cellula, i riarrangiamenti del gene del recettore dell’antigene linfocitario sono stabili per tutta la vita di un linfocita . Di conseguenza, se il linfoma a cellule B fosse stato una progressione trasformata della TZL precedentemente diagnosticata, allora il clone IGH dominante rilevato nel secondo campione avrebbe dovuto essere presente nel campione iniziale. Tuttavia, il campione iniziale aveva un diverso repertorio di cellule B policlonali e la sequenza del riarrangiamento IGH clonale non è stata rilevata nel campione iniziale.
L’uso di test di clonalità basati sul sequenziamento ha fornito un netto vantaggio rispetto ai metodi basati sull’elettroforesi. Tradizionalmente, la prova di clonalità utilizza l’elettroforesi del gel per visualizzare la diversità delle disposizioni del gene del ricevitore dell’antigene del linfocita in un dato campione. Poiché questo metodo distingue solo i geni del recettore dell’antigene per dimensione, può portare a risultati equivoci quando il segnale di un clone neoplastico viene spento dal rumore dei linfociti non neoplastici. Il test di clonalità basato sul sequenziamento produce una “risoluzione clonale” più elevata perché può distinguere i cloni dei linfociti in base alla sequenza in base alle dimensioni . In questo studio, i test basati sul sequenziamento hanno prontamente identificato i cloni TRB e TRG in entrambi i campioni nonostante la presenza di uno sfondo policlonale. Inoltre, l’identificazione delle sequenze geniche TRB e TRG del clone neoplastico ha determinato inequivocabilmente che il clone di cellule T dominante era identico in entrambi i campioni. Identificare i cloni per sequenza genica conferisce una maggiore fiducia in entrambi i cloni di essere identici che se i cloni sono identificati solo per dimensione. Un altro vantaggio del test di clonalità basato su NGS è che una volta determinata la sequenza di un clone neoplastico, può essere rintracciata nei campioni anche se comprende una frazione minima di tutti i riarrangiamenti . Nel caso attuale, l’identificazione della sequenza genica IGH dell’LBCL nel secondo campione ha permesso la ricerca di questa “sequenza indice” nel campione iniziale. Il fatto che la sequenza dell’indice IGH non sia stata trovata nel campione iniziale suggerisce fortemente che questo clone di cellule B non era presente nel momento in cui la TZL è stata inizialmente diagnosticata. Da notare, la sensibilità di rilevare un clone di indice dipende fortemente dalla profondità di sequenziamento.
Sebbene NGS fosse utile per identificare la presenza di due cloni distinti in questo caso, erano necessari anche altri approcci diagnostici. Un intero linfonodo interessato è stato inizialmente rimosso e valutato istopatologicamente e immunoistochimicamente per confermare la diagnosi citologica di TZL. Le sezioni consistevano in una popolazione omogenea di piccoli linfociti con rari follicoli rimanenti. La valutazione citologica di un aspirato del linfonodo popliteo controlaterale raccolto 1 anno dopo che il campione iniziale ha identificato le cellule morfologicamente coerenti con LBCL piuttosto che TZL, che ha richiesto la valutazione immunofenotipica. La citometria a flusso ha confermato LBCL, che in quasi tutti i casi nei cani è un DLBCL . Sebbene la valutazione istopatologica del linfonodo interessato non sia stata eseguita, i risultati citometrici di flusso di positività CD21, CD45 e MHC II combinati con grandi dimensioni cellulari sono stati altamente coerenti con la diagnosi di DLBCL . Tra i linfomi nei cani, la TZL è un’entità unica poiché anche senza terapia la neoplasia potrebbe non progredire affatto o solo lentamente; c’è una forte predilezione della razza; l’antigene pan-leucocitario CD45 è tipicamente non rilevabile sulle cellule tumorali; e l’antigene delle cellule B CD21 può essere presente a basso livello . Inoltre, le cellule con questo immunofenotipo sono state identificate in cani Golden Retriever più anziani senza evidenza di neoplasia linfoide, e alcuni di questi cani sono stati anche segnalati per avere popolazioni di cellule T clonali . Da notare, la risoluzione dei picchi clonali con metodi basati sull’elettroforesi è inferiore rispetto ai metodi basati sul sequenziamento, ed è concepibile che le popolazioni clonali identificate mediante elettroforesi possano essere più diverse se valutate mediante sequenziamento. Pertanto, molti aspetti della biologia di TZL rimangono caratterizzati in modo incompleto.
È possibile che il cane in questo rapporto avesse un aumentato rischio di sviluppare neoplasie secondarie in seguito alla radiazione del tumore al cervello. La radioterapia induce una moltitudine di effetti avversi, compresi gli effetti sistemici della terapia locale . Tali effetti possono compromettere il sistema immunitario, che a sua volta potrebbe ridurre la sorveglianza immunitaria e aumentare il rischio di successivo sviluppo del cancro. Mentre nell’uomo l’irradiazione tumorale è più spesso associata a neoplasie mieloidi secondarie, associazioni simili nei cani sono indeterminate . In generale, la conoscenza delle lesioni genetiche alla base della linfomagenesi nei cani è scarsa e una serie limitata di mutazioni è stata più altamente associata alla razza che al tipo di linfoma .
Il trattamento e la prognosi del linfoma composito nell’uomo variano a seconda del sottotipo istologico . Il TZL canino ha un decorso indolente della malattia, ma il DLBCL è un linfoma aggressivo con sopravvivenza libera da progressione mediana di 251-252 giorni, se trattato con chemioterapia di combinazione . La terapia di induzione per il cane in questo rapporto era una dose standard di L-asparaginasi e vincristina, ma non era prevista una risposta clinica duratura a causa della precedente esposizione a lungo termine ai glucocorticoidi . Sfortunatamente, nonostante una risposta favorevole iniziale, la terapia non è stata continuata e l’esito non è stato completamente valutato.
Al paziente era stata diagnosticata una massa intracranica più compatibile con glioma diversi mesi prima della prima diagnosi di linfoma. Senza valutazione istopatologica, non possono essere completamente escluse cause non neoplastiche di masse cerebrali come eventi vascolari o infiammazioni granulomatose. Tuttavia, le caratteristiche cliniche e le caratteristiche MRI di posizione intra-assiale, iperintensità T2 / FLAIR, ipointensità T1, mancanza di miglioramento del contrasto e effetto di massa, erano più suggestive di una neoplasia come un glioma di basso grado . La radioterapia definitiva ha provocato almeno 16 mesi di risposta obiettiva del tumore in questo paziente, che è simile o leggermente più lungo di quanto riportato per altri tumori intra-assiali .
Le limitazioni a questa indagine erano l’indisponibilità di una biopsia dal linfonodo con TZL/LBCL concomitante e la mancanza di valutazione post mortem. L’istopatologia e l’immunoistochimica del secondo linfoma avrebbero permesso una diagnosi più definitiva di LBCL e illustrato i risultati morfologici associati a TZL e LBCL simultanei. Allo stesso modo, la valutazione post mortem avrebbe permesso l’identificazione conclusiva della lesione cerebrale e dell’estensione del linfoma. Tuttavia, l’evidenza di un linfoma composito in questo caso è stata considerata molto forte sulla base di molteplici approcci diagnostici sofisticati e complementari.
In conclusione, questo rapporto di un linfoma composito in un cane evidenzia il valore di approcci diagnostici multipli per differenziare tra due linfomi de novo piuttosto che la trasformazione di un singolo clone.