SOPRA: Batteri (rosa) accogliente fino a dividere le cellule tumorali del colon-retto (blu) in questo micrografo elettronico a scansione a falsi colori.
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Nel film Fantastic Voyage del 1966, una squadra di scienziati viene ridotta per adattarsi a un piccolo sottomarino in modo che possano navigare nel sistema vascolare del loro collega e liberarlo da un coagulo di sangue mortale nel suo cervello. Questo film classico è uno dei tanti viaggi biologici fantasiosi che sono arrivati sul grande schermo negli ultimi decenni. Allo stesso tempo, gli scienziati hanno lavorato per rendere una visione simile una realtà: piccoli robot in roaming il corpo umano per rilevare e curare la malattia.
Sebbene i sistemi con nanomotori e il calcolo a bordo per la navigazione autonoma rimangano foraggio per la finzione, i ricercatori hanno progettato e costruito una moltitudine di sistemi micro e nanoscala per applicazioni diagnostiche e terapeutiche, specialmente nel contesto del cancro, che potrebbero essere considerati i primi prototipi di nanorobot. Dal 1995, più di 50 nanofarmaci, fondamentalmente una sorta di dispositivo su nanoscala che incorpora un farmaco, sono stati approvati dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. Se un farmaco di questa classe possiede una o più caratteristiche robotiche, come il rilevamento, il calcolo a bordo, la navigazione o un modo per alimentarsi, gli scienziati possono chiamarlo nanorobot. Potrebbe essere un nanoveicolo che trasporta un farmaco, naviga verso o si aggrega preferenzialmente in un sito tumorale e si apre per rilasciare un farmaco solo su un certo trigger. Il primo nanofarmaco approvato era DOXIL, una nanoshell liposomiale che trasportava il farmaco chemioterapico doxorubicina, che uccide in modo non selettivo le cellule ed è comunemente usato per trattare una serie di tumori. Le nanoshell somministrate per via endovenosa si accumulano preferenzialmente nei tumori, grazie a una vascolarizzazione che perde e a un drenaggio inadeguato da parte del sistema linfatico. Lì, le nanoparticelle rilasciano lentamente il farmaco nel tempo. In questo senso, le forme di base di nanorobot sono già in uso clinico.
La navigazione precisa verso i siti tumorali rimane un santo graal della ricerca e dello sviluppo di nanorobot.
Gli scienziati possono manipolare la forma, le dimensioni e la composizione delle nanoparticelle per migliorare il targeting del tumore e i sistemi più recenti impiegano strategie che riconoscono specificamente le cellule tumorali. Tuttavia, la navigazione precisa verso i siti tumorali rimane un santo graal della ricerca e dello sviluppo di nanorobot. Una meta-analisi del 2016 che valuta l’efficienza dei veicoli di nanodelivery testati in studi sugli animali nei precedenti 10 anni ha rivelato che una mediana di meno dell ‘ 1% dei nanoveicoli iniettati ha effettivamente raggiunto il sito tumorale e che questo potrebbe essere solo marginalmente migliorato con meccanismi di targeting attivi, come la decorazione superficiale con anticorpi specifici o peptidi per il legame
Come possiamo rendere questi nanobot migliori nel dirigersi verso i siti tumorali? La trasmissione di energia wireless rimane una sfida enorme e le batterie non sono ancora efficienti su scala nanometrica. I ricercatori hanno utilizzato forze esterne come ultrasuoni o campi magnetici per promuovere l’homing di nanomedicines ai tessuti tumorali, ma la fluidodinamica del lavoro sistema circolatorio contro nanoshuttles, il cui rapporto superficie-volume è 1 miliardo di volte quello degli oggetti sulla scala dei metri. Ciò fa sì che le forze di superficie e di trascinamento diventino più dominanti: per la nanoparticella, potrebbe sembrare di muoversi attraverso il miele durante la navigazione nell’ambiente acquoso del sistema vascolare.
Ma come spesso accade, la natura potrebbe avere solo una soluzione: i batteri. Gli organismi microscopici nuotano autonomamente attraverso i fluidi, guidati da motori molecolari che fanno girare le loro ciglia o flagelli in modo simile a un cavatappi-un meccanismo di propulsione molto efficace su questa scala che ha ispirato molti nanorobotisti che cercano di imitare questa funzionalità. I ricercatori hanno fabbricato elicoidali, nuotatori magnetici che possono essere filate in avanti da un campo magnetico rotante, per esempio. Ma i batteri, soprattutto nel contesto del trattamento del cancro, sono più di semplici modelli di ruolo per il nuoto efficiente; alcuni sono in realtà essi stessi terapeutici. Inoltre, i microbi possono percepire segnali biochimici e regolare le loro traiettorie di conseguenza, in modo simile al calcolo a bordo previsto.
L’idea di usare i batteri per curare il cancro non è nuova. Uno dei primi rapporti sui batteri come terapia del cancro proviene dal pioniere dell’immunoterapia William Coley, che alla fine del 19 ° secolo riconobbe che alcuni malati di cancro che soffrivano anche di infezioni della pelle avevano maggiori probabilità di migliorare. Ha iniziato a iniettare tossine batteriche, microbi inattivati dal calore o persino colture vive di batteri streptococchi nei suoi pazienti con tumori ossei e dei tessuti molli inoperabili, portando spesso a remissioni. Era un approccio audace, dato il rischio di infezioni incontrollabili da queste formulazioni batteriche prima della diffusa disponibilità di antibiotici. In gran parte a causa di questo pericolo, e la promessa dei concetti nascenti di radiazioni e chemioterapia, l’uso clinico dei batteri come agenti terapeutici per il cancro è andato sottosviluppato. Oggi, questa idea rivoluzionaria sta vivendo una rinascita.
Grazie alla convergenza di campi dalla biologia e chimica alla scienza dei materiali, all’ingegneria e all’informatica, si stanno aprendo nuove strade per lo sviluppo di terapie batteriche per il cancro. I toolkit messi a disposizione grazie alla riduzione dei costi sia di sequenziamento e sintesi del DNA, insieme con approcci sintetici-biologia per la progettazione genetica personalizzata di comportamenti batterici-like, stanno spianando la strada per i campi emergenti di micro – e nanorobotica.
Una storia di Nanoingegneria e terapia batterica
Nanorobot ingegnerizzati che possono vagare all’interno del corpo per rilevare e trattare i tumori sono stati una visione per l’ultimo mezzo secolo, e l’idea di utilizzare i batteri per combattere il cancro è ancora più vecchio di quello. I ricercatori hanno capito che alcuni batteri possiedono innatamente alcuni tratti di un nanorobot: possono autonomamente cercare tumori e hanno payload prontamente tossici che possono uccidere le cellule tumorali. Combinando i batteri con approcci classici nella robotica e nell’ingegneria per il controllo e la guida esterni, i ricercatori potrebbero ora trasformare l’idea un tempo immaginaria di un nanorobot che combatte il cancro in realtà-e il robot è vivo.
Batteri con carichi utili anti-cancro
Il Bacillus Calmette-Guérin (BCG), un batterio attenuato tipicamente usato come ceppo vaccinale per la tubercolosi, è stato riproposto negli ultimi decenni per trattare localmente il cancro della vescica. Il concetto alla base di questo approccio, simile a quello postulato da Coley, è che la somministrazione di batteri stimola il sistema immunitario del paziente a combattere il cancro.
Ancora meglio, anche se all’insaputa di Coley, molti batteri (anche se, per motivi sconosciuti, non BCG) hanno anche il potenziale per crescere in modo selettivo all’interno di tumori solidi, nella vescica e altrove; ridotto sorveglianza immunitaria nel tumorale ipossica e ambiente acido fornisce batteri anaerobici con un rifugio sicuro per crescere e prosperare. Mentre all’interno dei tumori, alcuni batteri producono tossine e competono con le cellule tumorali per i nutrienti. In definitiva, l’accumulo di batteri all’interno del tumore induce l’infiltrazione delle cellule immunitarie, che può quindi portare a risposte anti-cancro. Tuttavia, nonostante abbia testato molti ceppi batterici presenti in natura e prodotti in laboratorio in modelli animali di cancro e abbia condotto studi umani che testano i batteri per trattare il cancro, i ricercatori hanno osservato poca efficacia oltre i benefici che continuano ad essere visti nei pazienti con cancro alla vescica.
Di conseguenza, il campo si è spostato su batteri geneticamente ingegnerizzati per servire da traghetti per carichi utili ricombinanti. Il targeting selettivo e la successiva crescita dei batteri nei tumori, insieme alla consegna locale di terapie facilitate dai microbi stessi, potrebbero ridurre al minimo il danno collaterale alle cellule sane che è comune con le terapie sistemiche del cancro. Diversi gruppi hanno ingegnerizzato i batteri per produrre un’ampia varietà di carichi, tra cui tossine antitumorali, citochine e fattori che inducono l’apoptosi. La produzione di carichi terapeutici potenzialmente tossici richiede un ulteriore controllo sui batteri, nel caso in cui atterrino in luoghi che non dovrebbero. Pertanto, i ricercatori si stanno ora muovendo verso sistemi batterici di nuova generazione per rilevare un segnale fisiologico e rispondere producendo un terapeutico nel sito locale della malattia.
Per aiutare in questo obiettivo, negli ultimi due decenni il campo della biologia sintetica ha sviluppato un repertorio di circuiti genetici per controllare i comportamenti microbici. Questi circuiti sono costituiti da motivi di feedback positivi e negativi per modulare le funzioni cellulari dinamiche, agendo come interruttori a levetta, oscillatori, contatori, biosensori e registratori—strumenti che i ricercatori hanno usato per progettare microbi che combattono il cancro.
Un esempio di controllo genetico sui batteri che combattono il cancro è il circuito di lisi sincronizzato sviluppato nel 2016 dal gruppo di Jeff Hasty presso l’Università della California, San Diego, in collaborazione con il laboratorio di Sangeeta Bhatia al MIT, dove entrambi abbiamo fatto la nostra formazione post-laurea. (TD è stato coautore di questo studio del 2016.) In questo circuito, i batteri si localizzano nei tumori e crescono fino a una densità critica, quindi si rompono in modo sincrono per rilasciare composti terapeutici che i microbi stavano producendo. Questo approccio, che sfrutta il quorum sensing batterico naturale, migliora diverse caratteristiche delle terapie batteriche precedentemente sviluppate, la maggior parte delle quali producono costitutivamente farmaci, il che significa che potrebbero produrre e rilasciare le terapie in aree indesiderate del corpo. Poiché i batteri raggiungono solo la densità critica all’interno dei tumori, si autodistruggono e rilasciano il loro carico terapeutico lì. Ciò porta alla potatura della popolazione microbica, impedendo la crescita incontrollata di batteri nel tumore o altrove. In un modello murino colorettale della metastasi del fegato, questo sistema ha provocato un aumento di due volte nella sopravvivenza una volta accoppiato con la chemioterapia, rispetto alla chemioterapia o ai batteri da solo.
Diversi gruppi hanno ulteriormente sviluppato questo approccio. Nel 2019, ad esempio, uno di noi (T. D.), insieme al microbiologo e immunologo della Columbia University Nicholas Arpaia e colleghi, ha creato batteri che hanno prodotto molecole note per bloccare i checkpoint immunitari, come CD47 o PD-L1, che ordinariamente mettono i freni sulle cellule immunitarie e quindi diminuiscono l’attività antitumorale. Come risultato del blocco di queste vie nei tumori, i batteri sono stati in grado di innescare le cellule T e di facilitare la clearance del cancro in un modello murino di linfoma. Sorprendentemente, anche i tumori non trattati all’interno degli animali trattati si sono ridotti, suggerendo che l’adescamento locale potrebbe innescare un’immunità antitumorale distante e duratura.
L’approccio di utilizzare i batteri come terapia del cancro sta iniziando ad attirare l’attenzione dell’industria biotech. Una società, BioMed Valley Discoveries, ha testato iniezioni delle spore di Clostridium novyi-NT, un anaerobo obbligato che può crescere solo in condizioni ipossiche ed è geneticamente attenuato in modo che non venga prodotta una tossina letale, in diversi studi clinici. Nei ratti, nei cani e nel primo paziente umano, il trattamento ha mostrato “risposte antitumorali precise, robuste e riproducibili”, secondo un rapporto del 2014.
Un’altra azienda, Synlogic, sta sviluppando batteri iniettati intratumoralmente progettati per produrre un agonista PUNGENTE (stimolatore dei geni dell’interferone) e agire come attivatore immunitario innato. I batteri sono percepiti e inghiottiti da cellule che presentano l’antigene che si sono infiltrate nel tumore, e all’interno di quelle cellule immunitarie attivano la via della PUNTURA, con conseguente rilascio di interferone e risposte delle cellule T specifiche del tumore. È in corso uno studio clinico di fase 1 per valutare questa terapia per il trattamento di tumori solidi refrattari e sono previsti studi per l’uso in combinazione con un inibitore del checkpoint.
I risultati di questi e di altri studi serviranno a guidare ulteriori innovazioni in termini di sicurezza ed efficacia per le terapie ingegnerizzate per il cancro batterico. Ad esempio, questi studi faranno luce non solo sull’efficacia terapeutica, ma sui livelli di colonizzazione batterica e sulla distribuzione nei tumori dei pazienti, sullo spargimento o sulla colonizzazione fuori bersaglio e sulla stabilità delle modificazioni genetiche nel tempo-fattori che sono stati studiati solo a livello dettagliato nei modelli murini. Una volta stabilita una prova di principio negli esseri umani, ci sarà una grande spinta per determinare il ceppo batterico ottimale, il carico utile, i circuiti e le impostazioni cliniche appropriate in cui utilizzare questi tipi di terapie.
Costruire batteri per combattere il cancro
I biologi sintetici stanno applicando nuove strategie nell’ingegneria genetica per codificare tratti e circuiti intelligenti nei batteri per un monitoraggio in vivo più efficace e la somministrazione di farmaci. Allo stesso tempo, gli ingegneri stanno sviluppando strumenti per il controllo esterno e la guida dei batteri con l’obiettivo di migliorare la loro capacità di trovare e accedere ai tumori. Ecco alcuni esempi.
Batterica bombe
Jeff Frettolosa dell’Università di California, San Diego, in collaborazione con Sangeeta Bhatia del MIT (e T. D. in Bhatia laboratorio), ha progettato un attenuato Salmonella enterica di un ceppo batterico in modo sincrono per il rilascio terapie contro il cancro, quando la popolazione raggiunge una densità critica, permettendo periodica di consegna di droga in tumori del mouse. L’effetto è basato sulla lisi di quorum, significante quando una densità critica delle cellule dei batteri è percepita dalla popolazione, lisano e rilasciano la droga, mentre i batteri di sopravvivenza continuano proliferare fino alla soglia critica è raggiunta ancora per ripetere il ciclo.
Nanostrutture codificate per l’imaging
Mikhail Shapiro dell’Università della California, Berkeley e colleghi hanno codificato nanostrutture riempite di gas in microrganismi, inclusi batteri e archaea. Queste strutture, quando prodotte dai microbi, fungono da agenti di contrasto per l’imaging a ultrasuoni, consentendo ai ricercatori di visualizzare dove vanno nel corpo—critico per la diagnostica del cancro e di monitorare lo stato del trattamento consentendo ai ricercatori di visualizzare l’accumulo batterico nei tumori nel tempo. Il gruppo ha recentemente dimostrato la multiplazione di questo approccio codificando un reporter distinto in ciascuno dei due batteri, E. coli e Salmonella, per localizzare e distinguere il microbo nelle viscere e nei tumori dei topi.
Navigazione assistita magneticamente
Sylvain Martel di Polytechnique Montréal e colleghi hanno attaccato nanoliposomi contenenti farmaci su un ceppo batterico magnetotatico chiamato MC-1 che è stato iniettato in prossimità di tumori nei topi. Questi batteri biomineralizzano naturalmente nanoparticelle magnetiche all’interno delle loro membrane, consentendo ai ricercatori di utilizzare campi magnetici per guidare i batteri verso—e—tumori, dove possono fornire terapie o servire come agenti di contrasto di imaging.
Luce brillante sui tumori
Di-Wei Zheng e colleghi dell’Università di Wuhan in Cina hanno usato la luce per migliorare le attività metaboliche di E. coli attaccando alle superfici dei batteri nanomateriali semiconduttori che sotto irradiazione luminosa producono fotoelettroni. Questi hanno innescato una reazione con le molecole endogene di nitrato dei batteri, aumentando la formazione e la secrezione di una forma citotossica di ossido nitrico di 37 volte. In un modello murino, il trattamento ha portato ad una riduzione dell ‘ 80% della crescita tumorale.
Guida a distanza di controllo dei batteri ai tumori
Mentre i ricercatori stanno riuscendo a batteri di ingegneria per trasportare o produrre composti antitumorali, meno dell ‘ 1 per cento di quei microbi raggiungerà tumori da soli. Poiché la maggior parte dei tumori non sono accessibili per iniezione diretta, i medici devono essere in grado di navigare efficacemente le terapie batteriche ai siti tumorali, dove i microbi dovrebbero rilasciare in modo affidabile e controllabile i farmaci tossici che codificano.
Questo è dove la biologia sintetica è stata influenzata dai principi della microrobotica. Ad esempio, E. i batteri coli possono essere ingegnerizzati con geni provenienti da microrganismi marini per rilevare e utilizzare l’energia luminosa. Nel 2018, Jochen Arlt e colleghi dell’Università di Edimburgo hanno dimostrato che tali ceppi fotosintetici di E. coli mobili potevano essere guidati attraverso campi di luce spazialmente modellati. In risposta ai modelli di esposizione alla luce, i batteri si sono spostati in determinate posizioni; tracciando la loro posizione ha informato il prossimo ingresso di luce per guidarli in avanti lungo un percorso predefinito—un processo noto come controllo a circuito chiuso, una parte fondamentale della robotica.
I nuovi toolkit genetici stanno aprendo la strada ai campi emergenti della micro e nanorobotica.
Nello stesso anno, Xian-Zheng Zhang e colleghi dell’Università di Wuhan in Cina hanno usato la luce per innescare localmente un aumento di 37 volte della produzione di citotossina batterica attaccando alle membrane dei batteri nanomateriali che, dopo l’esposizione alla luce, rilasciano foto-elettroni che promuovono la sintesi della tossina. In un modello murino di cancro al seno, questi batteri anaerobici si sono accumulati nel microambiente ipossico dei tumori e la successiva produzione di citotossina potenziata dalla luce ha provocato circa l ‘ 80% di inibizione della crescita tumorale. Questo è un esempio di come l’integrazione di materiale sintetico in batteri vivi può consentire il controllo remoto di determinate azioni o funzionalità, un’altra caratteristica presa in prestito dalla robotica classica.
Mentre la navigazione e il controllo attivati otticamente hanno un potenziale enorme, la limitata capacità della luce di penetrare nei tessuti ostacola l’approccio. Una forma più ampiamente utilizzata di energia esterna è l’ecografia. Ha avuto a lungo applicazioni nella diagnostica medica e nel monitoraggio. Più recentemente, le microbolle riempite di gas, dovuto la loro risposta acustica forte e distinta, sono usate per migliorare il contrasto sulle immagini di ultrasuono dei tessuti e le forme speciali di ultrasuono ad alta potenza e messo a fuoco sono state applicate nella terapia per amplificare il trasporto delle nanobolle riempite droga usando le onde acustiche di pressione come energia esterna per spingerle Questo approccio ha ottenuto risultati particolarmente promettenti nel glioblastoma, perché la barriera emato-encefalica è particolarmente difficile da superare per i farmaci. Un paio di anni fa, i ricercatori hanno utilizzato gli ultrasuoni per tracciare i batteri terapeutici in vivo. Mikhail Shapiro e colleghi del Caltech hanno ingegnerizzato geneticamente i batteri per esprimere ciò che hanno definito acoustic reporter genes (ARG), che codificano i componenti di strutture cave chiamate vescicole di gas che disperdono le onde ultrasoniche, generando un’eco che ha permesso loro di rilevare la posizione dei batteri in profondità all’interno di topi viventi.
Altre fonti comuni di energia esterna che possono essere applicate in modo sicuro e remoto nel corpo umano sono i campi magnetici. Mentre i sistemi di imaging a risonanza magnetica sono stati utilizzati clinicamente per decenni, lo sviluppo di sistemi per la guida e il controllo magnetico sono ancora abbastanza nuovi. Finora, i ricercatori hanno applicato l’approccio per guidare cateteri magnetici per la chirurgia di alta precisione. L’esempio più famoso è il sistema NIOBE di St. Louis-based Stereotaxis per il trattamento delle aritmie cardiache. Una punta del catetere magnetico è precisamente guidato lungo il tessuto cardiaco anormale, dove impulsi elettrici calore o raffreddare il dispositivo per ablare le cellule misfiring.
L’uso di strumenti magnetici simili per guidare i batteri nel contesto della terapia del cancro è stato proposto da gruppi che lavorano con batteri magnetotatici—microbi marini che sintetizzano naturalmente stringhe di nanoparticelle di ossido di ferro avvolte in un guscio lipidico. Questa caratteristica si è evoluta per aiutarli a navigare nell’acqua percependo il campo magnetico terrestre, con queste stringhe che funzionano come aghi della bussola all’interno dei loro corpi unicellulari. Questo è stato scoperto nel 1970 da Richard Blakemore di Woods Hole Oceanographic Institution in Massachusetts. Circa 40 anni dopo, Sylvain Martel del laboratorio di NanoRobotica di Polytechnique Montréal e colleghi hanno accoppiato questi batteri magnetotattici a DOXIL, il chemioterapico avvolto in liposomi che si è guadagnato il titolo della prima nanomedicina approvata. Anche il gruppo di Martel ha approfittato del fatto che i batteri anaerobici tendono a ospitare tumori per il loro ambiente a basso contenuto di ossigeno, e ha accoppiato quel meccanismo di homing naturale con un campo magnetico di direzione esterno, dimostrando un aumento dell’accumulo e della penetrazione della terapia nei tumori del topo. In un altro recente studio, uno di noi (Ss.), con ricercatori del MIT e dell’ETH di Zurigo, ha mostrato in modelli di tessuto su un chip che l’applicazione di campi magnetici rotanti potrebbe guidare sciami di tali batteri magnetotattici ad agire come piccole eliche, creando forti flussi per spingere nanomedicine compagno fuori dei vasi sanguigni e più in profondità nei tessuti.
Mentre l’uso di tali specie magnetotattiche all’interno del corpo umano potrebbe avvenire decenni in futuro, la codifica della magnetosensazione in altri ceppi batterici più traducibili clinicamente o già testati potrebbe essere un obiettivo raggiungibile a breve termine. Molte delle proteine coinvolte nel complesso processo di biomineralizzazione che forma i composti magnetici in batteri magneto-tattica sono stati identificati, e in un preprint pubblicato all’inizio di quest’anno, i ricercatori hanno riferito di ingegneria E. coli per formare particelle di magnetite e controllarli da campi magnetici esterni.
E. coliWIKIMEDIA commons, IDKLABUn’altra strada per rendere i batteri non magnetici controllabili dai campi magnetici è semplicemente attaccare materiali magnetici ad essi. I ricercatori hanno preso uno o anche più ceppi batterici e li hanno legati a micro o nanoparticelle magnetiche. Quando esposte a un campo magnetico esterno, queste particelle magnetiche si orienteranno con il campo, e così anche i batteri, che poi viaggeranno in quella direzione. Nel 2017, Metin Sitti e colleghi del Max Planck Institute for Intelligent Systems di Stoccarda, in Germania, hanno attaccato i batteri di E. coli alle microparticelle costituite da strati di doxorubicina chemioterapica e minuscole nanoparticelle magnetiche. Usando le cellule tumorali in un piatto, i ricercatori hanno dimostrato di poter controllare a distanza questi bot batterici che trasportano farmaci con magneti per migliorare il targeting delle cellule tumorali rispetto all’aggiunta di microparticelle caricate di droga alle cellule.
Non importa come, i batteri geneticamente modificati potenziati da fonti energetiche esterne che forniscono trigger, controllo e guida sono una nuova affascinante direzione in questo campo. Alimentati dalla convergenza di biologia sintetica, ingegneria meccanica e robotica, questi nuovi approcci potrebbero solo portarci un passo più vicino alla fantastica visione di piccoli robot che cercano e distruggono molti tipi di cancro.
Simone Schuerle è assistente professore presso l’ETH di Zurigo e membro dell’Istituto di Medicina Traslazionale dell’università. Tal Danino è un assistente professore alla Columbia University e membro del Centro oncologico completo Herbert Irving e del Data Science Institute.