Cromatografia liquida ad alte prestazioni la spettrometria di massa è una tecnica strumentale estremamente versatile le cui radici si trovano nell’applicazione della cromatografia liquida più tradizionale alle teorie e alla strumentazione originariamente sviluppate per la gascromatografia (GC). Come suggerisce il nome, la strumentazione comprende un cromatografo liquido ad alte prestazioni (HPLC) collegato, tramite un’interfaccia adatta, a uno spettrometro di massa (MS). Il vantaggio principale che HPLC/MS ha rispetto a GC / MS è che è in grado di analizzare una gamma molto più ampia di componenti. I composti che sono termicamente labili, presentano un’elevata polarità o hanno una massa molecolare elevata possono essere analizzati utilizzando HPLC / MS, anche le proteine possono essere analizzate di routine. Le soluzioni derivate da campioni di interesse vengono iniettate su una colonna HPLC che comprende un tubo di acciaio inossidabile stretto (di solito 150 mm di lunghezza e 2 mm di diametro interno o più piccolo) imballato con particelle di silice fini e chimicamente modificate. I composti sono separati in base alla loro interazione relativa con il rivestimento chimico di queste particelle (fase stazionaria) e il solvente che elude attraverso la colonna (fase mobile). I componenti che eluiscono dalla colonna cromatografica vengono quindi introdotti nello spettrometro di massa tramite un’interfaccia specializzata. Le due interfacce più comuni utilizzate per HPLC / MS sono la ionizzazione elettrospray e le interfacce di ionizzazione chimica a pressione atmosferica.
Ionizzazione elettrospray
Nella ionizzazione elettrospray l’analita viene introdotto alla sorgente a portate tipicamente dell’ordine di 1µl min-1. Il flusso della soluzione di analita passa attraverso l’ago elettrospray che presenta un’elevata differenza di potenziale (rispetto al contatore elettrodo) applicato ad esso (tipicamente nell’intervallo da 2,5 a 4 kV). Questo costringe la spruzzatura di goccioline cariche dall’ago con una carica superficiale della stessa polarità alla carica sull’ago. Le goccioline vengono respinte dall’ago verso il cono di campionamento sorgente sul contatore elettrodo (mostrato in blu). Quando le goccioline attraversano lo spazio tra la punta dell’ago e il cono, si verifica l’evaporazione del solvente. Questo è cerchiato sulla Fig.1 e ingrandito in Fig.2. Quando si verifica l’evaporazione del solvente, la goccia si restringe fino a raggiungere il punto in cui la tensione superficiale non può più sostenere la carica (il limite di Rayleigh), a quel punto si verifica una “esplosione coulombica” e la goccia viene squarciata. Ciò produce le più piccole goccioline che possono ripetere il processo come pure le molecole cariche nude dell’analita. Queste molecole di analita cariche (non sono strettamente ioni) possono essere caricate singolarmente o moltiplicate. Si tratta di un metodo di ionizzazione molto morbido in quanto pochissima energia residua viene trattenuta dall’analita al momento della ionizzazione. È la generazione di molecole a carica multipla che consente di analizzare componenti ad alto peso molecolare come le proteine poiché l’intervallo di massa dello spettrometro di massa è notevolmente aumentato poiché misura effettivamente il rapporto massa-carica piuttosto che la massa di per sé. Il principale svantaggio della tecnica è che viene prodotta pochissima (di solito nessuna) frammentazione, sebbene ciò possa essere superato attraverso l’uso di tecniche spettrometriche di massa tandem come MS / MS o MSn.
Figura 1 schematizzazione di un’interfaccia ESI
Figura 2 schema del meccanismo di formazione di ioni
pressione Atmosferica ionizzazione chimica
a ionizzazione chimica a pressione Atmosferica (APCI) un analogo metodo di ionizzazione a ionizzazione chimica (CI). La differenza significativa è che APCI si verifica a pressione atmosferica e ha le sue applicazioni primarie nelle aree di ionizzazione di composti a bassa massa (APCI non è adatto per l’analisi di composti termicamente labili). L’impostazione generale della sorgente (vedi Fig. 3) condivide una forte somiglianza con ESI. Dove APCI differisce da ESI, è nel modo in cui avviene la ionizzazione. In ESI, la ionizzazione è comprata circa attraverso la differenza di potenziale fra l’ago dello spruzzo ed il cono con la desolvazione rapida ma delicata. In APCI, la soluzione di analita viene introdotta in un nebulizzatore pneumatico e desolvata in un tubo di quarzo riscaldato prima di interagire con la scarica corona creando ioni. La scarica corona sostituisce il filamento elettronico in CI – la pressione atmosferica “brucerebbe” rapidamente qualsiasi filamento-e produce N2°+ e N4°+ primari per ionizzazione elettronica. Questi ioni primari si scontrano con le molecole di solvente vaporizzate per formare ioni di gas reagenti secondari-ad esempio H3O+ e (H2O)nH+ (vedi Fig. 4). Questi ioni gas reagenti subiscono poi ripetute collisioni con l’analita con conseguente formazione di ioni analita. L’alta frequenza delle collisioni si traduce in un’elevata efficienza di ionizzazione e termalizzazione degli ioni dell’analita. Ciò si traduce in spettri di specie prevalentemente molecolari e ioni addotti con pochissima frammentazione. Una volta che gli ioni si formano, entrano nella fase di pompaggio e messa a fuoco in modo molto simile a ESI.
Figura 3 schema dei componenti di una sorgente APCI
Figura 4 Una visione più dettagliata del meccanismo di APCI
Diagrammi e il testo (parziale) da parte del Dr Paolo Cancelli, Scuola di Chimica dell’Università di Bristol