L’avvento della biologia aerobica è stato annunciato circa due miliardi di anni fa, quando i cianobatteri primitivi hanno evoluto la capacità di fotoossidizzare l’acqua. L’ossigeno è stato rilasciato come prodotto di scarto e i livelli di O2 atmosferici sono aumentati rapidamente. Questo rapido cambiamento in un’atmosfera ossigenata ha introdotto un inquinante devastante, ma alla fine si sono evoluti organismi che hanno sfruttato la forte forza trainante per la riduzione dell’O2. I siti attivi enzimatici che erano in grado di legare e attivare l’ossigeno si sono evoluti e nuove classi di biochimica che utilizzano O2 come dissipatore termodinamico per guidare reazioni altrimenti sfavorevoli sono diventate possibili. L’efficienza del metabolismo alimentare è cambiata radicalmente. La quantità di ATP che potrebbe essere prodotta metabolizzando il glucosio aerobicamente, ad esempio, è aumentata di quasi 20 volte. Gli eucarioti apparvero poco dopo l’atmosfera ossigenata e alla fine furono seguiti dalla vasta gamma di organismi multicellulari che esistono oggi. Nella nostra biochimica aerobica, O2 è utilizzato in una pletora di reazioni sintetiche che sono fondamentali per quasi tutti gli aspetti della crescita cellulare, lo sviluppo e la riproduzione.
Nonostante la sua versatilità biochimica, tuttavia, > il 95% dell’ossigeno che consumiamo viene utilizzato nella respirazione. Gli elettroni ad alta energia derivati dal cibo attraversano la catena di trasporto degli elettroni mitocondriali in una serie di reazioni redox esergoniche. Questi trasferimenti di elettroni energeticamente in discesa vengono utilizzati per sviluppare il gradiente protonico chemisosmotico che alla fine produce ATP. L’ossigeno è l’accettore finale dell’elettrone in questa cascata respiratoria e la sua riduzione ad acqua è usata come veicolo da cui eliminare la catena mitocondriale degli elettroni spesi a bassa energia. L’enzima che catalizza questo processo, la citocromo ossidasi, attraversa la membrana mitocondriale. Lega, attiva e riduce fino a 250 molecole di O2 al secondo e accoppia l’energia rilasciata in questo processo alla traslocazione di protoni che contribuiscono al gradiente chemiosmotico. Il meccanismo con cui la citocromo ossidasi catalizza questa notevole chimica è stato studiato intensamente. I risultati riportati in questo numero da Fabian, Wong, Gennis e Palmer forniscono nuove informazioni su questo processo e supportano la crescente nozione che esistono concetti unificanti per il modo in cui gli enzimi che utilizzano l’ossigeno attivano O2 per la scissione e la riduzione del legame O O O (1).
La riduzione di O2 nella citocromo ossidasi si verifica in condizioni di grave costrizione. Il processo avviene con poco potere eccessivo, il rilascio di intermedi di ossigeno tossici parzialmente ridotti dal sito attivo è ridotto al minimo e l’energia libera disponibile nella riduzione di O2 è accoppiata ad alta efficienza alla traslocazione di protoni (2, 3). L’enzima opera sotto questi vincoli utilizzando un eme Fe, chiamato eme a3, e uno ion di rame, chiamato CuB, in un centro binucleare in cui O2 si lega e si riduce (vedi Fig. Fico.1).1). L’ingresso di elettroni in questo sito avviene dal citocromo c per mezzo di un secondo ferro eme, eme a, e un secondo centro di rame, CuA. Recentemente, il gruppo di Yoshikawa (4) e il gruppo di Michel (5) hanno fornito in modo indipendente e simultaneo strutture cristalline dell’enzima che hanno dato una visione profonda di molti aspetti del ciclo catalitico, in particolare di come i protoni e l’ossigeno possano muoversi attraverso la proteina. Il meccanismo di riduzione dell’O2 da parte dell’ossidasi è stato perseguito da un certo numero di gruppi con una varietà di tecniche spettroscopiche (per le revisioni, vedere refs. 6 e 7). Da questo lavoro, una sequenza di reazione semplificata che coinvolge intermedi transitori, ma rilevabili, al centro binucleare può essere scritta come segue (vedi anche Fig. Fico.2):2):
Le specie P e F, in particolare, hanno attirato l’attenzione, in quanto sono state implicate nel meccanismo di pompaggio che guida la traslocazione dei protoni (8). I recenti lavori di Michel (9) e di Wikström e colleghi (10) hanno evidenziato sia i progressi che le incertezze nella nostra comprensione del meccanismo che accoppia i trasferimenti di elettroni esergonici all’ossigeno con il movimento del protone endergonico attraverso la membrana.
Il centro binucleare nella citocromo ossidasi. Eme a3 e CuB sono mostrati insieme al ligando prossimale per il ferro eme, H376, e il ligando CuB, H240, che è reticolato a Y244 (24, 25). Il legame e la riduzione dell’O2 si verificano nella regione tra il ferro a3 e il cucciolo.
Uno schema semplificato per la reazione tra citocromo ossidasi e O2. Viene mostrato il sito binucleare, che contiene eme a3, CuB e la struttura reticolata H240-Y244 (HY). La riduzione e la protonazione della forma ossidata del centro produce il sito ridotto. Questo lega O2 per formare inizialmente la specie ossi, che reagisce ulteriormente per produrre intermedi P e F, prima di rigenerare la forma ossidata dell’enzima. La riduzione di P e F è limitata dalle reazioni di trasferimento di protoni, come indicato. I passaggi tra P e la forma ridotta del sito sono stati implicati nei processi di pompaggio dei protoni, che sono indicati dalle frecce rosse. La stechiometria di questi passaggi è una questione di indagine corrente, anche se fino a quattro protoni possono essere pompati durante il ciclo completo.
Un problema continuo nel svelare la chimica dell’ossigeno al centro binucleare nella citocromo ossidasi e il suo legame con la pompa protonica è quello di stabilire le strutture molecolari degli intermedi nello schema sopra. C’è consenso che l’intermedio F coinvolge un intermedio ferryl-oxo a eme a3, a34+O O (3, 6, 11, 12), ma la struttura di P è stata oggetto di notevoli controversie. Le assegnazioni iniziali di questa specie postulavano che conteneva un legame intatto, a33 + – O2 species specie, quindi la sua designazione come P per “perossi” (ad esempio, ref. 3, 8 e 13). Weng e Baker, tuttavia, interpretarono i loro dati ottici per indicare che la scissione del legame O O O era già avvenuta a P e che anche questa specie aveva una struttura a34+O O al centro binucleare (14). Questa conclusione è stata successivamente supportata da diverse indagini spettroscopiche (15-17). Kitagawa, Proshlyakov e i loro colleghi sono riusciti a utilizzare la spettroscopia Raman per rilevare il movimento di allungamento a34+⩵O (18, 19) in una forma di P generata aggiungendo perossido all’enzima ossidato. Lavori successivi hanno mostrato che la stessa vibrazione potrebbe essere osservata quando l’ossigeno viene aggiunto a una forma ridotta a due elettroni dell’enzima, confermando che la chimica dell’ossigeno e la chimica del perossido nell’ossidasi procedono attraverso intermedi comuni (20). Inoltre, il corso temporale dell’apparizione di P in questo lavoro ha dimostrato che questa specie è cineticamente competente (vedi anche rif. 21 e 22). Quindi, dal lavoro spettroscopico, e anche dal recente lavoro computazionale (23), la vista emergente è che P è davvero una specie spaccata dal legame O O O.
Il lavoro riportato da Fabian et al. (1) fornisce nuove prove, indipendenti e convincenti che il legame O O O è scisso nella citocromo ossidasi a livello P. Nei loro esperimenti, hanno ragionato che né atomo di ossigeno in una struttura di perossi legame intatto è probabile scambiare con acqua solvente. Se P si verifica come specie a34 + ⩵O, tuttavia, ci si aspetta che il secondo atomo di ossigeno sia probabilmente a livello di idrossido o acqua e che questo ossigeno possa scambiarsi con l’acqua nel tampone acquoso. Usando 18O2 come substrato in un tampone acquoso che conteneva H216O, hanno intrappolato l’intermedio P e analizzato per l’aspetto di H218O. I loro risultati spettrometrici di massa mostrano chiaramente che un singolo atomo di ossigeno dal substrato 18O2 è scambiabile con acqua solvente, in eccellente accordo con la loro analisi di cui sopra e l’assegnazione di P come una specie ferril-osso spaccata dal legame.
La consapevolezza che P ha una struttura a34+structure O ha una serie di importanti implicazioni. La trasformazione di O2 legato nella specie ossi in idrossido (o acqua) e un ferryl-oxo in P richiede un totale di quattro elettroni. Solo tre, tuttavia, sono prontamente disponibili nel centro binucleare: due da eme a3 mentre va dallo stato di valenza +2 a +4 e uno da CuB mentre viene ossidato da ramoso a ramoso. La fonte del quarto elettrone non è chiara. L’ossidazione del macrociclo eme, come avviene nei composti I in alcune perossidasi, può essere eliminata sulla base di Raman e dati ottici (6, 7), e Cu3+ non è stato rilevato in ambiente biologico. Il candidato più probabile, quindi, è una catena laterale della proteina redox-attiva, come si verifica nella citocromo c perossidasi, in cui il triptofano è redox attivo, o nella prostaglandina sintasi, che contiene un residuo di tirosina ossidabile (24). Yoshikawa e colleghi (25) hanno fornito prove cristallografiche sorprendenti che supportano fortemente il verificarsi di una catena laterale redox-attiva. Hanno dimostrato che Y244 nel centro binucleare è reticolato a uno dei ligandi CuB, H240, e che il gruppo di testa del fenolo è orientato in modo che il gruppo −OH punti direttamente nella cavità di legame O2 (Fig. (Fico.1).1). Michel ha riportato dati cristallografici simili (26) e Buse e colleghi hanno recentemente riportato dati biochimici che supportano l’occorrenza del crosslink H240-Y244 (27). Sono stati riportati anche dati EPR recenti che indicano la presenza di radicali tirosilici quando il perossido viene aggiunto all’enzima a riposo, sebbene le specifiche catene laterali coinvolte non siano state identificate(28, 29). Presi insieme, questi risultati suggeriscono fortemente che la tirosina reticolata è la fonte del quarto elettrone nell’attivazione e nella riduzione di O2 da parte della citocromo ossidasi. Questa congettura porta al ciclo di reazione semplificato in Fig. Fico.2,2, in cui la struttura H-Y reticolata è mostrata esplicitamente e proposta per essere ossidata al radicale tirosilico neutro nell’intermedio P.
Lo schema in Fig. Fico.22 evidenzia le analogie tra citocromo ossidasi e perossidasi e catalasi in termini di chimica di scissione del legame ossigeno–ossigeno e in termini di prodotti che risultano dalla reazione. Nell’ossidasi, l’enzima estrae tre elettroni dai metalli nel sito attivo e un quarto elettrone da una frazione organica per ridurre O2 in un solo passaggio a O⩵ e OH—. Entrambi questi prodotti sono a livello di acqua, anche se ulteriore protonazione e rilascio si verificano solo in fasi successive della reazione. Nelle perossidasi e nelle catalasi, l’enzima estrae un elettrone da un metallo nel sito attivo e un secondo elettrone da una frazione organica per ridurre H2O2 in un solo passaggio a O⩵ e OH—. Nelle perossidasi e nelle catalasi, il prodotto immediato di questa chimica è il composto I, che contiene una specie ferryl-oxo e un radicale organico. Queste strutture sono esattamente analoghe alla struttura a34 + ⩵O/radicale che si verifica in P nella citocromo ossidasi. Il radicale organico nel composto I viene ridotto in una fase successiva negli enzimi perossidasi e catalasi per produrre il composto II, che mantiene la struttura ferril-osso. Nell’ossidasi, la stessa chimica si verifica per produrre l’intermedio F. La somiglianza in chimica delle proteine eme che metabolizzano l’ossigeno è emersa solo con la realizzazione della struttura a34+⩵O per P e suggerisce che altri enzimi che metabolizzano l’ossigeno possono seguire lo stesso tipo di chimica nell’attivazione e riduzione dell’ossigeno e dei perossidi.
Una strategia interessante emerge dalla Fig. Fico.22 in termini di come l’ossidasi accoppia la chimica dell’ossigeno alla pompa protonica. Le fasi di pompaggio si verificano solo dopo che P è stato formato (8-10), il che significa che l’enzima prima attiva e riduce O2 a molecole di acqua di prodotto completamente ridotte ma non completamente protonate; l’enzima completa il trasferimento di elettroni a quattro elettroni in ossigeno e memorizza l’energia libera che risulta altamente ossidante a34+⩵O e specie radicali, prima di impegnare la pompa. Recenti calcoli sulla chimica della scissione del legame supportano questa idea, poiché i risultati indicano che la riduzione di O2 in osso e idrossido con formazione di un radicale e di un ferril-osso è vicina al termoneutrale (23). Ciò rappresenta una strategia notevolmente efficace per evitare le specie tossiche e parzialmente ridotte dell’ossigeno, poiché nessuna si verifica nel ciclo di reazione. Inoltre, trasferendo l’energia libera che verrà utilizzata per guidare la pompa dai prodotti di ossigeno sottostato alla proteina, sembra che l’ossidasi abbia massimizzato il controllo e l’efficienza con cui può far funzionare l’apparato di traslocazione dei protoni.