Durante la traslocazione passo della fase di allungamento della sintesi proteica, il mRNA è avanzata da un codone, accoppiato con il movimento del trna da ribosomiale Un (amminoacil) a P (peptidilica) e P (uscita) siti, in un processo catalizzato da fattore di allungamento EF-G (1). In primo luogo, i tRNA si muovono sulla subunità 50S negli stati ibridi P/E e A/P, seguiti dal movimento dei tRNA anticodon stem-loops (ASL) dalla subunità 30S A e P siti ai siti P ed E, rispettivamente, accoppiato al movimento dei loro codoni mRNA associati (2). Il primo passo è accompagnato dalla rotazione intersubunit (3-7), mentre il secondo passo richiede EF-G·GTP e prevede la rotazione del dominio head della subunità 30S (8-11). Anche se molto è stato recentemente appreso circa la base strutturale del movimento P-tRNA al sito E(9, 10, 12, 13), gli intermedi di traslocazione contenenti A-tRNA sono più difficili da intrappolare. Quindi, gran parte del nostro pensiero sulla base strutturale del movimento A-tRNA e mRNA è stato basato su strutture cristalline di EF-G legate a complessi ribosomici vacanti (14) o contenenti P-tRNA intrappolati in stati classici (15) o ibridi (10, 12, 13) e due strutture crioem di complessi ribosomi-EF-G degli anni ‘ 70 contenenti due tRNA legati in stati ibridi P/E e A/P* (16), o in stati ibridi chimerici ap/P e pe/E (11).
Qui riportiamo la struttura cristallina di un intermedio di traslocazione del ribosoma 70S contenente EF-G, mRNA e due tRNA – un tRNA deacilato legato nello stato pe/E e un peptidil-tRNA intrappolato in uno stato ibrido chimerico ap / ap. Il complesso è stato formato con ribosomi T. thermophilus 70S, un mRNA a 39 nucleotidi, tRNAMet dell’elongatore nel sito P e N-acetil-Val-tRNAVal nel sito A. Per intrappolare l’intermedio di traslocazione, abbiamo aggiunto neomicina per bloccare il completamento della traslocazione e acido fusidico per prevenire il rilascio di EF-G (Metodi supplementari; Fig. S1). La struttura è stata risolta utilizzando i dati di diffrazione a 3,8 Å ottenuti da un singolo cristallo (Tabella S1). Esempi di densità elettronica sono mostrati in materiali supplementari (Fig. S2–S13). Rispetto al ribosoma a stato classico (17), la testa della subunità 30S subisce una grande rotazione di 21° in senso antiorario e il corpo 30S una rotazione di 2,7° rispetto alla subunità 50S (Fig. 1, Figura 2A, lettera B). Il P-tRNA anticodon stem-loop (ASL) si muove con la testa 30S in una posizione tra il sito P della testa 30S e il sito E del corpo 30S (stato chimerico pe; Fig 1D, E), mentre la sua estremità accettore si muove completamente nel sito 50S E (Fig 1C), formando uno stato ibrido chimerico pe/E (9-11). L’A-tRNA ASL si sposta all’interno di ~4Å degli elementi del sito P del corpo degli anni ‘ 30 (Fig. 1D); il suo gomito ruota verso il classico sito 50S P, ma la sua estremità accettore è legata tra i siti 50S subunità A e P (Fig. 1C), formando uno stato ibrido chimerico ap/ap. La grande rotazione EF-G-dipendente della testa 30S nella nostra struttura riposiziona l’elica H38 di 23S rRNA, consentendo al gomito A-tRNA di raggiungere la posizione del gomito tRNA P-site (Fig. S14). Il dominio IV di EF-G è incuneato nel sito di convergenza del codone mRNA del sito A, del ciclo anticodonico del tRNA ap/ap e degli RRNA 16S e 23S al ponte intersubunitario B2a, contattando simultaneamente tutti e quattro gli RNA (Fig. S15).
(A) ribosoma degli anni ‘ 70 con tRNA legati negli stati classici A/A e P/P (17); (B) Complesso intermedio di traslocazione, che mostra tRNA intrappolati negli stati ap/ap e pe / E ibridi chimerici intermedi. (C) Confronto delle posizioni di tRNA negli stati classici e nell’intermedio di traslocazione, allineate sulla subunità 50S; (D) posizioni relative di tRNA ASL, allineate sul corpo della subunità 30S o (E) testa. I componenti molecolari sono colorati in tutto come: 16S rRNA, ciano; 30S proteine, blu; 23S rRNA, grigio; 5S rRNA, azzurro; 50S proteine, magenta; mRNA, verde; A/A e ap / ap tRNA, giallo; P/P e pe / E tRNA, rosso; EF-G, arancione.
(A-B) Posizioni di tRNA nel ribosoma (A) stato classico e (B) intermedio di traslocazione. (C-D) Interazioni dei tRNA ASL e mRNA mentre si spostano dagli stati classici (C) A e P agli stati ibridi chimerici (D) ap e pe. (E-F) Il riarrangiamento del loop 966 (h31) di 16S rRNA nella testa della subunità 30S dalla sua posizione di legame P-tRNA classica (E) a (F) forma una tasca di montaggio superficiale attorno all’ap/ap tRNA ASL.
Sebbene la rotazione della testa di 30S faciliti chiaramente la traslocazione del sito P ASL (9-11), il sito A ASL viene traslocato da un meccanismo diverso. L’ASL del sito P si muove precisamente con la rotazione della testa 30S nello stato pe / E, mentre l’ASL del sito A si è spostata oltre il movimento rotatorio della testa nello stato ap sulla subunità 30S (Fig. 1E). Il movimento dell’A-site ASL proprio con la rotazione della testa comporterebbe un grave scontro con il dominio IV di EF-G in quanto posizionato nel nostro complesso, il che, insieme al contatto formato tra la punta del dominio IV e l’elica codone-anticodone del tRNA ap/ap (Fig S16), suggerisce che il movimento di mRNA e ASL sia accoppiato a quello del dominio IV. Lo spostamento aggiuntivo dell’ap/ap ASL lo avvicina all’ASL pe/E (Fig. 2 QUATER, D) (11). La posizione della testa può essere stabilizzata dall’interazione tra fosfato 1210 di 16S rRNA con dominio IV di EF-G a Gly531.
Più sorprendente è il riarrangiamento del ciclo 16S rRNA 966 nella testa 30S, che si stacca dal sito P per raggiungere verso il sito A, dove inizia il contatto con l’ap/ap-ASL parzialmente traslocato (Fig. 2 SEXIES, F). Questo riarrangiamento comporta l’interruzione dell’imballaggio di m22G966 contro ribosio 34 del sito P ASL (18, 19) e la formazione di una tasca di montaggio superficiale attorno all’ap/ap-ASL da parte dei nucleotidi A965, m22G966 e C1400. In una struttura cristallina del corrispondente complesso single-tRNA (10) (Fig. S6), il pe/E tRNA ASL è stato trovato per mantenere tutti i contatti canonici P-site con la testa 30S, incluso il loop 966, mentre ruota verso il sito E. Tuttavia, nel complesso a due tRNA riportato qui, vengono mantenute solo un sottoinsieme delle interazioni della testa P-site 30S con l’ASL pe/E, coinvolgendo G1338, A1339, A1340 e la coda C-terminale della proteina uS9. La formazione di interazioni post-traslocazione simultaneamente con l’interruzione delle interazioni pre-traslocazione, suggerisce un meccanismo per il modo in cui le ASL vengono distribuite tra i siti A e P. Può anche rappresentare uno spostamento iniziale nei contatti che deve essere interrotto per rilasciare il pe / E tRNA ASL prima della rotazione posteriore della testa 30S nelle fasi finali della traslocazione (20, 21).
La rete di interazioni formata tra il ciclo conservato 1 (residui 499-504) nel dominio IV di EF-G, l’ap / ap ASL e il suo codone mRNA (Fig. S15) (11) sono simili a quelli osservati nello stato post-traslocazione (15), suggerendo che sono mantenuti per tutto il ciclo di traslocazione. La loro somiglianza con le interazioni della scanalatura minore fatte da A1492 e A1493 con l’elica codone-anticodone nel sito di decodifica (22) suggerisce che possono aiutare a mantenere il corretto accoppiamento codone-anticodone durante il movimento tra i siti A e P (15) e sono coerenti con la proposta che EF-G facilita la traslocazione destabilizzando le interazioni nel sito di decodifica degli anni ‘ 30 (23).
Le interazioni tra l’mRNA e gli elementi della testa 30S all’interno del tunnel di ingresso dell’mRNA a valle sono state proposte per portare l’mRNA in avanti con il tRNA durante la rotazione della testa (17). Tuttavia, non è chiaro che il movimento netto dell’mRNA potrebbe essere sostenuto in questo modo, perché queste interazioni vengono interrotte durante la rotazione della testa. Troviamo che la coda estesa dell’mRNA, mentre emerge dal tunnel a valle, curva verso l’alto per legarsi alla superficie della proteina uS3 nella testa della subunità (Fig. 3, S17). Pertanto, la rotazione della testa in avanti sposterebbe attivamente l’mRNA nella direzione della traslocazione. Il confronto della posizione di un nucleotide di riferimento sull’mRNA negli stati ruotati e non ruotati mostra inoltre che la rotazione della testa in avanti farebbe avanzare l’mRNA di un codone (Fig. 3D), sostenendo la possibilità che l’mRNA sia attivamente spostato dal ribosoma durante la traslocazione. Poiché le dimensioni del tunnel a valle escludono l’ingresso di un’elica di RNA, la rottura della struttura secondaria dell’mRNA da parte dell’elicasi ribosomiale (24) deve avvenire all’ingresso o in prossimità del tunnel, per interazione con il ribosoma all’esterno del tunnel. Il legame della coda dell’mRNA che fiancheggia immediatamente l’ingresso del tunnel esclusivamente alla testa degli anni ‘ 30 fornisce tale interazione. Le forze create dalla rotazione della testa potrebbero quindi destabilizzare l’accoppiamento di base negli elementi elicoidali dell’mRNA mentre entrano nel tunnel a valle.
(A) L’ingresso nel tunnel di ingresso dell’mRNA a valle è circondato dalle proteine uS3, uS4 e uS5. Posizioni da +14 a +21 contattare un cerotto caricato positivamente sulla superficie della proteina uS3 nella testa degli anni ‘ 30 (Fig. S17). B) Percorso dell’mRNA a valle e C) vista ruotata di 90°. (D) L’attracco sul corpo degli anni ‘ 30 della struttura classica (17) (grigio) mostra che la rotazione della testa nella struttura intermedia ap/ap trasferisce l’mRNA di un codone. Codone A (giallo) e codone P (rosso).
Nello stato classico, C74 e C75 nella coda CCA del tRNA del sito P formano coppie di basi con G2252 e G2251, rispettivamente, nel ciclo P (H80) di 23S rRNA, mentre C75 del tRNA del sito A si accoppia con G2553 nel ciclo A (H92) (18, 25, 26). Queste interazioni posizionano le parti peptidil e amminoacil per la reazione peptidil transferasi (27), che lascia un tRNA deacilato nel sito P e un tRNA peptidilico nel sito A. Un passo critico nella traslocazione è quindi il successivo movimento dell’estremità peptidil-CCA dal ciclo A al ciclo P. La struttura dell’intermedio di traslocazione rivela uno stato chimerico, distinto da quelli precedentemente descritti (Fig. S18), in cui l’estremità accettore del peptidil-tRNA interagisce simultaneamente con entrambi i loop A e P (Fig 4). In questo stato, l’accoppiamento di base di C75 con G2553 del ciclo A viene conservato, mentre il movimento del suo stelo accettore in una posizione vicina a quella del classico tRNA del sito P consente a G2252 e G2253 in un ciclo P riorganizzato di contattare la spina dorsale del tRNA nelle posizioni 72 e 70 (Fig. 4 TER). Pertanto, l’estremità dello stelo accettore del ap/ap-tRNA è ancorata sul ciclo P, facilitando il trasferimento dei suoi residui adiacenti C74 e C75 dal ciclo A al ciclo P. A76 del tRNA ap / ap è orientato in modo simile a quello osservato per il tRNA legato nello stato classico P/P (17), con la sua porzione peptidilica N-acetil-valina posizionata all’ingresso del tunnel di uscita del peptide, mentre C74 e C75 mantengono le loro interazioni con il ciclo A di 23S rRNA (Figs. 4, S19).
Durante la traslocazione, l’estremità accettore 3′ di peptidyl-tRNA si sposta dallo stato (A) classico A/A allo stato (B) intermedio ap/ap allo stato (C) classico P / P, facilitato dai cambiamenti conformazionali nei loop A e P.
L’ap / ap-tRNA può corrispondere a stati intermedi che sono stati caratterizzati cineticamente. Studi cinetici di tempra a fluorescenza hanno identificato un intermedio EF-G-dipendente (INT) in cui il gomito peptidil-tRNA si muove dal sito A verso il sito P, ma rimane solo parzialmente reattivo con la puromicina mimica aminoacil-tRNA, suggerendo che la sua estremità CCA non è completamente alloggiata nel sito P (28). Studi cinetici in cui una sonda è stata attaccata direttamente all’estremità CCA peptidil-tRNA, hanno identificato intermedi di traslocazione EF-G-dipendenti in cui l’estremità accettore del peptidil-tRNA si muove verso il sito P, ma rimane puromicina-non reattivo (29). Le proprietà di questi intermedi sono compatibili con lo stato ap/ap intrappolato osservato qui. La struttura di questo intermedio di traslocazione intrappolato inizia a descrivere come il tRNA si muove tra i siti ribosomiali A e P. I siti di legame tRNA stessi sono dinamici, formando contatti simultanei tra l’A-tRNA e gli elementi di entrambi i siti A e P, simile al passaggio del testimone in una staffetta (30). Questo è visto sia per gli anni ’30 e’ 50 subunità. Nella subunità 30S, il riarrangiamento del ciclo 966 di 16S rRNA rilascia G966 dal sito P ASL per contattare l’A-site ASL mentre si sposta nel sito 30S P (Fig. 2 SEXIES, F). Nella subunità 50S, i loop A e P di 23S rRNA si riorganizzano per consentire a entrambi i loop di contattare l’estremità 3 ‘ – accettore del tRNA del sito A quando inizia la sua transizione nel sito 50S P (Fig. 4). Questi risultati mostrano che le dinamiche strutturali dell’RNA ribosomiale svolgono un ruolo attivo nel meccanismo di traslocazione.