Robert De Niro Sr. è nato a Syracuse, New York, da una madre irlandese-americana, Helen M. (nata O’Reilly; 1899-1999). La madre di Helen era Mary E. Burns (nata da John e Mary Burns) e suo padre era Dennis Francis O’Reilly, nato da Ellen Hall di Dundrum, la seconda moglie di Edward O’Reilly. C’era una precedente confusione sulla maternità di Dennis, sua madre in precedenza pensava di essere la seconda moglie di Edward, Margaret.
Padre italo-americano di Robert, Henry Martin De Niro (1897-1976), nacque da genitori emigrati da Ferrazzano nel 1887, Angelina Mercurio e Giovanni Di Niro.
Robert era il maggiore di tre figli; lui e i fratelli John e Joan sono stati cresciuti a Syracuse, New York. De Niro ha studiato al famoso Black Mountain College sotto Josef Albers dal 1939 al 1940. Mentre l’approccio altamente analitico di Albers alla pittura non piaceva allo stile più istintivo di De Niro, l’esperienza e la prospettiva internazionale del maestro del Bauhaus hanno comunque lasciato un’impressione duratura. De Niro ha studiato con Hans Hofmann alla sua scuola estiva di Provincetown, Massachusetts. L’insegnamento di Hofmann sull’espressionismo astratto e il formalismo cubista ebbe una forte influenza sullo sviluppo di De Niro come artista maturo.
Alla scuola estiva di Hofmann, incontrò la collega Virginia Admiral, che sposò nel 1942. La coppia si trasferì in un grande e arioso loft nel Greenwich Village di New York, dove furono in grado di dipingere. Si circondarono di un’illustre cerchia di amici, tra cui gli scrittori Anaïs Nin e Henry Miller, il drammaturgo Tennessee Williams e l’attrice e famosa ballerina berlinese Valeska Gert. Admiral e De Niro si separarono poco dopo che il loro figlio Robert De Niro Jr. nacque nell’agosto del 1943 dopo che De Niro uscì come gay. Nel 1944, De Niro ebbe una relazione con il poeta Robert Duncan.
Dopo aver studiato con Hans Hofmann a New York e Provincetown e Josef Albers al Black Mountain College, North Carolina tra la fine degli anni ’30 e l’inizio degli anni’ 40, De Niro lavorò per cinque anni al leggendario Museo di Arte non oggettiva di Hilla Rebay. Nel 1945, fu incluso in una mostra collettiva all’Art of This Century di Peggy Guggenheim a New York, che era una galleria leader per l’arte di modernisti europei affermati e membri del gruppo espressionista astratto emergente come Jackson Pollock, Mark Rothko, Robert Motherwell e Clyfford Still. De Niro ha avuto la sua prima mostra personale alla galleria Guggenheim in aprile e maggio dell’anno successivo. A quel punto, stava principalmente lavorando in modo astratto, spesso con riferimenti figurali. Gran parte del suo lavoro di questo periodo è andato perso in un incendio in studio nel 1949.
De Niro ha avuto una serie di mostre personali nel 1950 alla Charles Egan Gallery di New York, che ha esposto il lavoro di Willem de Kooning e altri primi artisti espressionisti astratti. I critici hanno elogiato le composizioni di DeNiro piene di aree improvvisate di colori vivaci che hanno lasciato il posto a nature morte vagamente dipinte e nudi sinuosi. Verso la metà degli anni 1950, De Niro fu regolarmente incluso in importanti mostre collettive come il Whitney Annual, lo Stable Annual e il Jewish Museum. Ha ricevuto un premio Longview Foundation nel 1958.
Dal 1961 al 1964, De Niro viaggiò in Francia per dipingere a Parigi e nella campagna circostante. Collezionista Joseph Hirshhorn acquistato un certo numero di dipinti dell’artista e opere su carta durante questo periodo attraverso gallerista di De Niro, Virginia Zabriskie, che sono ora nella collezione permanente del Hirshhorn Museum and Sculpture Garden di Washington, DC. Nel 1968 gli fu assegnata una Guggenheim Fellowship.