Utilizzando il sequenziamento dell’exoma, gli studi a costo fisso possono sequenziare campioni a una profondità molto più elevata di quella che potrebbe essere raggiunta con il sequenziamento dell’intero genoma. Questa profondità aggiuntiva rende il sequenziamento exome adatto a diverse applicazioni che necessitano di chiamate varianti affidabili.
Mappatura variante rara in disturbi complessimodifica
Gli attuali studi di associazione si sono concentrati sulla variazione comune in tutto il genoma, in quanto questi sono i più facili da identificare con i nostri saggi attuali. Tuttavia, le varianti che causano malattie di grande effetto sono state trovate trovarsi all’interno degli esomi negli studi sui geni candidati e, a causa della selezione negativa, si trovano in frequenze alleliche molto più basse e possono rimanere non tipizzate negli attuali test di genotipizzazione standard. Il sequenziamento dell’intero genoma è un metodo potenziale per testare la nuova variante in tutto il genoma. Tuttavia, nei disturbi complessi (come l’autismo), si pensa che un gran numero di geni sia associato al rischio di malattia. Questa eterogeneità del rischio sottostante significa che per la scoperta dei geni sono necessarie dimensioni molto grandi del campione, e quindi il sequenziamento dell’intero genoma non è particolarmente conveniente. Questo problema di dimensione del campione è alleviato dallo sviluppo di nuovi metodi analitici avanzati, che mappano efficacemente i geni della malattia nonostante le mutazioni genetiche siano rare a livello di variante. Inoltre, le varianti nelle regioni di codifica sono state studiate molto più estesamente e le loro implicazioni funzionali sono molto più facili da derivare, rendendo le applicazioni pratiche delle varianti all’interno della regione dell’esoma mirata più immediatamente accessibili.
Il sequenziamento dell’esoma nella scoperta di geni di varianti rare rimane un’area di ricerca molto attiva e in corso: ad oggi, pochi geni associati sono stati scoperti finora, ma ci sono prove crescenti che un carico significativo di rischio è osservato in tutti gli insiemi di geni.
Scoperta dei disturbi mendelianimodifica
Nei disturbi mendeliani di grande effetto, i risultati finora suggeriscono uno o un numero molto piccolo di varianti all’interno dei geni codificanti alla base dell’intera condizione. A causa della gravità di questi disturbi, si presume che le poche varianti causali siano estremamente rare o nuove nella popolazione e mancherebbero a qualsiasi test di genotipizzazione standard. Il sequenziamento Exome fornisce chiamate di varianti ad alta copertura in tutte le regioni di codifica, necessarie per separare le varianti vere dal rumore. Un modello di successo della scoperta del gene mendeliano prevede la scoperta di varianti de novo utilizzando il sequenziamento trio, in cui i genitori e il probando sono genotipizzati.
Case studiedit
Uno studio pubblicato nel settembre 2009 ha discusso un esperimento proof of concept per determinare se fosse possibile identificare varianti genetiche causali utilizzando il sequenziamento degli esomi. Hanno sequenziato quattro individui con sindrome di Freeman-Sheldon (FSS) (OMIM 193700), una rara malattia autosomica dominante nota per essere causata da una mutazione nel gene MYH3. Otto individui HapMap sono stati anche sequenziati per rimuovere varianti comuni al fine di identificare il gene causale per FSS. Dopo l’esclusione di varianti comuni, gli autori sono stati in grado di identificare MYH3, il che conferma che il sequenziamento dell’esoma può essere utilizzato per identificare varianti causali di disturbi rari. Questo è stato il primo studio riportato che ha utilizzato il sequenziamento dell’esoma come approccio per identificare un gene causale sconosciuto per un raro disturbo mendeliano.
Successivamente, un altro gruppo ha riportato una diagnosi clinica di successo di un sospetto paziente con sindrome di Bartter di origine turca. La sindrome di Bartter è una malattia renale da spreco di sale. Il sequenziamento dell’esoma ha rivelato un’inaspettata mutazione recessiva ben conservata in un gene chiamato SLC26A3 che è associato a diarrea congenita di cloruro (CLD). Questa diagnosi molecolare di CLD è stata confermata dal medico di riferimento. Questo esempio ha fornito la prova del concetto dell’uso del sequenziamento dell’intero esoma come strumento clinico nella valutazione di pazienti con malattie genetiche non diagnosticate. Questo rapporto è considerato come la prima applicazione della tecnologia di sequenziamento di nuova generazione per la diagnosi molecolare di un paziente.
Un secondo rapporto è stato condotto sul sequenziamento dell’esoma di individui con un disturbo mendeliano noto come sindrome di Miller (MIM#263750), una rara malattia di ereditarietà autosomica recessiva. Sono stati studiati due fratelli e due individui non correlati con sindrome di Miller. Hanno esaminato varianti che hanno il potenziale per essere patogene come mutazioni non sinonimi, siti di accettore di giuntura e donatori e brevi inserimenti o eliminazioni di codifica. Poiché la sindrome di Miller è una malattia rara, si prevede che la variante causale non sia stata precedentemente identificata. Precedenti studi di sequenziamento degli esomi di polimorfismi comuni a singolo nucleotide (SNPS) in database SNP pubblici sono stati utilizzati per escludere ulteriormente i geni candidati. Dopo l’esclusione di questi geni, gli autori hanno trovato mutazioni nel DHODH che sono state condivise tra individui con sindrome di Miller. Ogni individuo con sindrome di Miller era un eterozigote composto per le mutazioni DHODH che sono state ereditate come ogni genitore di un individuo affetto è stato trovato per essere un vettore.
Questa è stata la prima volta che il sequenziamento dell’esoma ha dimostrato di identificare un nuovo gene responsabile di una rara malattia mendeliana. Questa scoperta emozionante dimostra che il sequenziamento dell’esoma ha il potenziale per individuare i geni causali in malattie complesse, che in precedenza non è stato possibile a causa di limitazioni nei metodi tradizionali. La cattura mirata e il sequenziamento massicciamente parallelo rappresentano una strategia economica, riproducibile e robusta con elevata sensibilità e specificità per rilevare le varianti che causano cambiamenti di codifica delle proteine nei singoli genomi umani.
Diagnostica clinicamodiFica
Il sequenziamento dell’esoma può essere utilizzato per diagnosticare la causa genetica della malattia in un paziente. L’identificazione delle mutazioni genetiche della malattia di base può avere importanti implicazioni per gli approcci diagnostici e terapeutici, può guidare la previsione della storia naturale della malattia e consente di testare i membri della famiglia a rischio. Ci sono molti fattori che rendono il sequenziamento dell’esoma superiore all’analisi del singolo gene, inclusa la capacità di identificare mutazioni in geni che non sono stati testati a causa di una presentazione clinica atipica o la capacità di identificare casi clinici in cui mutazioni di geni diversi contribuiscono ai diversi fenotipi nello stesso paziente.
Dopo aver diagnosticato una causa genetica di una malattia, queste informazioni possono guidare la selezione del trattamento appropriato. La prima volta che questa strategia è stata eseguita con successo nella clinica è stata nel trattamento di un bambino con malattia infiammatoria intestinale. In precedenza era stata utilizzata una serie di diagnostica convenzionale, ma i risultati non potevano spiegare i sintomi del bambino. L’analisi dei dati di sequenziamento degli esomi ha identificato una mutazione nel gene XIAP. La conoscenza della funzione di questo gene ha guidato il trattamento del bambino, portando a un trapianto di midollo osseo che ha curato il bambino dalla malattia.
I ricercatori hanno utilizzato il sequenziamento dell’esoma per identificare la mutazione sottostante per un paziente con sindrome di Bartter e diarrea congenita da cloruro. Il gruppo di Bilgular ha anche utilizzato il sequenziamento dell’esoma e ha identificato la mutazione sottostante per un paziente con gravi malformazioni cerebrali, affermando “evidenzia l’uso del sequenziamento dell’esoma intero per identificare i loci della malattia in contesti in cui i metodi tradizionali si sono dimostrati impegnativi… I nostri risultati dimostrano che questa tecnologia sarà particolarmente preziosa per la scoperta genica in quelle condizioni in cui la mappatura è stata confusa dall’eterogeneità del locus e dall’incertezza sui confini della classificazione diagnostica, indicando un futuro luminoso per la sua ampia applicazione alla medicina”.
I ricercatori dell’Università di Città del Capo, in Sud Africa, hanno utilizzato il sequenziamento dell’esoma per scoprire la mutazione genetica del CDH2 come causa alla base di una malattia genetica nota come cardiomiopatia aritmogena del ventricolo destro (ARVC)’ che aumenta il rischio di malattie cardiache e arresto cardiaco.
Direct-to-consumer exome sequencingEdit
Più aziende hanno offerto exome sequencing ai consumatori.
Knome è stata la prima azienda ad offrire servizi di sequenziamento exome ai consumatori, ad un costo di diverse migliaia di dollari. Più tardi, 23andMe ha eseguito un programma pilota WES che è stato annunciato nel settembre 2011 ed è stato interrotto nel 2012. I consumatori potrebbero ottenere dati exome ad un costo di $999. La società ha fornito dati grezzi e non ha offerto analisi.
Nel novembre 2012, DNADTC, una divisione di Gene per Gene ha iniziato ad offrire exomi a copertura 80X e prezzo introduttivo di $695. Questo prezzo per sito web DNADTC è attualmente $895. Nell’ottobre 2013, BGI ha annunciato una promozione per il sequenziamento dell’intero exome personale a copertura 50X per $499. Nel giugno 2016 Genos è stato in grado di ottenere un prezzo ancora più basso di $399 con un exome consumer 75X certificato CLIA sequenziato dalla saliva.