Il tuo consulente ti dice che vuole che tu usi HPLC per analizzare il tuo composto. Sai che hai sentito parlare di questa tecnica prima, ma non riesci a ricordare cosa significa HPLC, per non parlare di come farlo! Ci siamo passati tutti, e scommetto che avresti voluto prestare più attenzione in quella conferenza!
Non temere – in questa serie di articoli ti ricorderò la potenza della colonna HPLC
In questo primo articolo, ti porterò attraverso il principio alla base dell’HPLC e ti ricorderò i suoi usi-sarai pronto per il laboratorio in pochissimo tempo!
Come funziona HPLC?
La cromatografia liquida ad alte prestazioni, o HPLC, è un nome lungo per una tecnica potente basata sul semplice fatto che i singoli composti si comportano diversamente in acqua.
L’HPLC separa e purifica i composti in base alla loro polarità, o alla loro tendenza ad apprezzare o meno l’acqua. Per mettere la polarità nel contesto, considera che l’olio è un liquido apolare che non si mescola con l’acqua. L’etanolo, d’altra parte, è polare e come molti di voi sanno, si mescola molto bene con l’acqua (Vodka e coca qualcuno??).
Ho cercato di semplificare l’intero processo nella Figura 1 qui sotto, ma prima diamo un’occhiata ai principali componenti coinvolti in HPLC. Scuse in anticipo per qualche gergo inevitabile!
I componenti
La colonna HPLC
Questa è anche conosciuta come fase stazionaria. Questo è il cavallo di battaglia della macchina HPLC, è fatto da una varietà di sostanze (spesso silice) ed è molto compatto in natura. Le particelle di silice sono funzionalizzate da lunghe catene di carbonio. Le catene di carbonio sono apolari e quindi più lunga è la catena, più la colonna diventa apolare. Le colonne contenenti catene a 18 carbonio sono comunemente utilizzate e sono note come colonne C18.
Il campione HPLC
I tipi di campione variano notevolmente a seconda del campo e del tipo di composti in questione. HPLC può essere utilizzato per analizzare composti in campioni biologici (urina, sangue, saliva e muscoli), campioni ambientali, chimica medicinale (farmaci) e microbiologia (tossine prodotte da funghi e batteri).
Iniezione del campione
I campioni vengono iniettati nella colonna HPLC. Questo usato per essere effettuata manualmente, il che significa che qualche povera anima ha dovuto sedersi accanto alla macchina HPLC per ore e ore iniettando ogni campione con una siringa, a volte tutta la notte!
Fortunatamente, i modelli più recenti hanno un iniettore automatico, riducendo l’input manuale e consentendo un throughput più elevato. Le macchine moderne sono dotate di software che consente all’utente di inserire un elenco di campioni, quanto e in quale ordine dovrebbero essere iniettati. Così si può godere il vostro pranzo mentre il vostro HPLC si esegue!
La fase mobile
Questa è in realtà solo una miscela di acqua e un solvente organico (di solito acetonitrile o metanolo). La fase mobile prende il nome perché si muove attraverso la colonna e allo stesso tempo eluta (o svuota) i composti dalla colonna.
I composti sono spesso eluiti lungo un gradiente di concentrazione. Se sei come me, concentrazione e gradiente sono due parole che odi vedere riunirsi in una frase! Significa solo che la percentuale di acqua nella fase mobile diminuisce nel tempo, mentre la percentuale del solvente apolare aumenta simultaneamente. Ciò significa che la fase mobile diventa gradualmente più apolare. Non preoccuparti troppo dei gradienti per ora, poiché appariranno di nuovo in un articolo di follow-up.
L’esecuzione HPLC
HPLC può essere eseguita in diverse modalità. Il metodo più comunemente usato è noto come fase inversa (RP-HPLC) e questo è ciò che descrivo qui. In questa modalità, i composti vengono separati a partire dal più polare e terminano con i composti apolari. Per tutte le modalità, una pompa ad alta potenza sposta il campione e la fase mobile attraverso la colonna. Una corsa tipica può richiedere tra 10-60 minuti.
Il principio alla base di HPLC – uno sguardo più da vicino
Ora che avete un’idea dei componenti coinvolti, passiamo al principio in un po ‘ più in dettaglio.
Ho detto sopra che l’HPLC separa i composti sulla base della polarità. Ma come funziona in realtà? Inglese per favore! Come il gradiente calci in, la concentrazione di solvente aumenta mentre la concentrazione di acqua diminuisce. Questo rende la fase mobile sempre più apolare. I composti contenuti nel campione si attaccano alle catene di carbonio nella colonna, con i composti più apolari che attaccano i più forti e i composti più polari che si attaccano debolmente.
La figura 1 mostra cosa succede a un campione contenente una miscela di composti dopo l’iniezione nella colonna. I composti si legano alla colonna e vengono svuotati in tempi diversi, a seconda che siano più propensi a aderire alla colonna o alla fase mobile mentre viene pompata. Il tempo in cui ogni composto eluta (o scarica) dalla colonna è noto come tempo di ritenzione di quel composto (Rf).
Figura 1: Il principio alla base di HPLC
Figura 1: Composti di polarità diverse (indicati come tonalità di blu scuro) vengono iniettati nella colonna HPLC (intero cilindro). La fase mobile viene pompata attraverso la colonna e l’aggiunta di solvente lungo un gradiente di concentrazione (mostrato come una linea tratteggiata nera) diminuisce continuamente la polarità complessiva della fase mobile (asse Y). I composti sono in grado di aderire alla colonna o alla fase mobile, a seconda di quanto sono polari. I composti alla fine si attaccheranno alla fase mobile quando la loro polarità corrisponde a quella della fase mobile. Si dissocieranno quindi dalla colonna e verranno eluiti in un determinato momento (asse X) durante l’esecuzione. Questa volta è conosciuta come la Rf per quel composto.
Comprensione dell’output
L’output o i risultati di un’esecuzione HPLC sono generalmente visti come un cromatogramma (Figura 2). Si tratta di una serie orizzontale di picchi che rappresentano composti eluiti dalla colonna con diversi valori Rf. Le moderne apparecchiature HPLC sono spesso accoppiate a un rivelatore a matrice di diodi (DAD), consentendo all’utente di esaminare il cromatogramma risultante di composti separati in lunghezze d’onda da 190 nm a 900 nm. Se i composti in esame sono noti, l’utente può scegliere di guardare solo a 1 o alcune lunghezze d’onda selezionate. Ad esempio, la cocaina può essere osservata a 254 nm.
Figura 2: Un tipico cromatogramma HPLC
Figura 2: Questo cromatogramma mostra la separazione dei composti da una reazione chimica e il cromatogramma viene visualizzato a 254 nm. Due picchi principali si verificano a 8.20 e 9 minuti, che rappresentano due composti con questi tempi di ritenzione. Il numero di unità di assorbanza (AU) viene visualizzato sull’asse Y mentre il tempo di esecuzione viene visualizzato sull’asse X.
Applicazioni
All’interno della biologia e della medicina, l’HPLC è spesso usato come strumento analitico per analizzare campioni biologici e ambientali per la presenza o l’assenza di composti noti (ad esempio metaboliti, farmaci, tossine, pesticidi) e può aiutare nell’identificazione di composti sconosciuti.
All’interno della chimica, tuttavia, l’HPLC viene abitualmente utilizzato per monitorare le reazioni chimiche e per determinare la purezza dei prodotti. Inoltre, il processo di HPLC può essere modificato in HPLC preparativo, per cui i composti di interesse possono essere purificati per un ulteriore utilizzo.
L’HPLC può sembrare molto complicato all’inizio, ma stai tranquillo, proprio come la maggior parte delle altre tecniche di laboratorio, ha molto più senso quando lo fai effettivamente.
Restate sintonizzati per i miei articoli di follow-up nelle prossime settimane, in cui passerò attraverso alcune indicazioni su come è possibile ottenere il meglio dalla vostra corsa HPLC a seconda del vostro obiettivo di ricerca, così come discutere oggettivamente come HPLC può essere utilizzato all’interno della vostra ricerca.
Ci sono altri aspetti di questa tecnica che vorresti trattati in modo più dettagliato? Se è così, ci piacerebbe sentire da voi!
Happy HPLC-ing 
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