枯草菌および大腸菌における減衰器の特性評価
枯草菌における減衰または抗終末調節によって調節されるオペロンの広範な文献検索が行われ、46個のオペロンが発見された。 これらは、実験的によく記述されたtrpオペロンから、ターミネータ構造が発見され、実験的には十分に特徴付けられていないが減衰が期待されるオペロンまでの範囲である（完全なリストについてはhttp://www.bork.embl-heidelberg.de/Docu/attenuationを参照）。 これらの46の既知のターミネータ構造は、b.subtilis減衰ターミネータの共通の特性を決定するために採用されました。 これらの特性を使用して、我々はターミネーターフォールドのための3650b.subtilis遺伝子（材料および方法に記載の手順を使用して）の上流領域をスクリーニングした。 文献検索で見つかった元の46の既知のターミネーターの四十から三は、このスクリーニングで保持されました。 私達の規準に合う付加的な1117の上流の折目はまた得られた。 さらに、対照として、我々は配列がランダムにシャッフルされた後、遺伝子間領域に同じフィルタリングと折り畳み方法を使用した（ランダムにシャッフ
フィルタリング後に得られたすべての遺伝子間領域およびシャッフル配列の得られた折り目を、その安定性および長さの観点からプロットした（図1）。 既知のターミネータフォールドは、ランダムにシャッフルされたシーケンスのフォールドとは明確に分離され、区別されるクラスターにある。 ターミネータフォールドは、ランダム列の予測フォールドよりも長さに関連して小さい自由エネルギー（Δ G）である。 既知のターミネータ構造を、ターミネータが見つからないと予想される折り畳まれた遺伝子内領域と比較すると、二つの容易に分離されたクラスタの同様のパターンが現れる（データは示されていない）。
枯草菌の上流シーケンスセグメントにおけるステムループ構造の安定性と長さ分布。 赤い線は、シャッフルされたシーケンス内のステムループ構造から派生した最大の分散（材料と方法を参照）を示しています。 水色の線は、標準偏差に基づいて有意差の測定値を与えます。 各点の定義と隣接する遺伝子の向きは、右上のパネルに示されています。
主成分分析を使用して、ランダムにシャッフルされたシーケンスの最大分散を決定しました。 これは、折り目がランダムシーケンスの折り目とは大きく異なる尺度（標準偏差を使用）を与えることができます（材料と方法を参照）。 1160フォールドのうち、私たちの画面で得られた遺伝子間領域の203フォールドの合計は、主成分から派生した2番目の偏差線（Z≤-2）を下回っています。 したがって、これらは、ランダムな折り目および減衰または反終端規制の可能な終端部位とは有意に異なると考えられる。 これらのうち42個は既知の減衰ターミネータの折り目である（フィルタリング後に維持された元の43個の既知の折り目のうち）。 したがって、我々は我々のフィルタと有意性尺度を使用して、既知および実験的に特徴付けられた減衰および反終了サイトの91.3％（42/46）を得ることができ さらに、フィルターと有意性の尺度は、ランダムシーケンスの折り目の97.7％（930の952）以上を選別します。 ライン（Z≤-2）の下の百六十から一（203合計42既知を除く）折り目はまだ実験的に解析されておらず、減衰ターミネータ構造であると予測することができます。
詳細な調査では、これらの予測の多くは、推定プロモーター配列の存在、推定および既知のオペロンの上流の位置などのゲノムコンテキストによって推定減衰または抗終末部位として強く支持されていることが分かった。 上流遺伝子ydbJとyqhIの二つのターミネーター構造は、ゲノムコンテキストがどのように通知し、表1（図2）で行われた予測を強く支持することができるかの詳細な例として役立つ（図2）。 Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの遺伝子ｙｄｂｊは，ＡＢＣトランスポーター遺伝子（銅輸送に関与するＡＴＰ結合蛋白質）と相同性を有する仮説として記載されている。 すぐ下流の遺伝子、ydbKは、膜スパニングペルミセスに相同性を持っています。 STRING（隣接遺伝子の繰り返しのインスタンスを見つけるための検索ツール）を使用して、これら二つの遺伝子のオルソログはまた、15の他の遠く関連するゲノ これらの遺伝子は典型的なABCトランスポーターオペロン配置であるように見え、いくつかのABCトランスポーターオペロンはb.subtilisの減衰によって調節されることが知られている。 ＹＤＢＪ上流領域はまた、推定プロモーター配列を有し、上流配列全体のＲｎａｆｏｌｄ（材料および方法を参照）を使用して予測された折り目は、複雑な可能性のある反終止フォールドで折り曲げることができることを示唆している（データは示されていない）。 この文脈に基づいて，これは減衰によって調節されるＡＢＣトランスポータオペロンであると予測した。 第二の例、yqhIは、推定転写単位でグリシン生合成遺伝子に相同性を有する三つの遺伝子のランの最初の遺伝子である。 この三つの遺伝子の実行はまた、他のゲノムの隣人として発見されたオルソログを持っています。 Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける多くのアミノ酸生合成オペロンは減衰によって調節されることが知られており，この予測を支持している。
枯草菌遺伝子ydbJおよびyqhIの近傍および予測構造の模式図。 遺伝子は着色された矢印によって示され、参照遺伝子（ydbJまたはyqhI）の配向に関連して転写の配向にある。 “T”は標準的なターミネーターフォールドである。 遺伝子間領域はスケールに描画され、これらのbpの長さは図の下に与えられます。
観測されたパターンは、減衰または抗terminationがよく研究され、実験的に記述されている唯一の他のゲノムのために保持するかどうかを確認するために、我々はまた、16オペロンが減衰または抗terminationによって調節されていると記載されている大腸菌ゲノム内の遺伝子の上流領域に同じ方法論を適用しました。 図3に見ることができるように、既知の大腸菌の減衰および抗終止ターミネーター構造は、枯草菌のものと同様の特性を有する。 15の16の既知の減衰器は、フィルタリング後に維持された。 有意性の尺度は、図3に見られるように、これらの大腸菌ターミネーターの14をランダムな折り目から分離する。 B.subtilisのように、有意性の尺度として（Z≤-2）線を使用して、146の領域の減衰を予測することができます（図3と表2）。
大腸菌における上流配列セグメントにおけるステムループ構造の安定性と長さ分布。 赤い線は、シャッフルされたシーケンス内のステムループ構造から派生した最大の分散（材料と方法を参照）を示しています。 水色の線は、標準偏差に基づいて有意差の測定値を与えます。 各点の定義と隣接する遺伝子の向きは、右上のパネルに示されています。p>
26ゲノムへの分析の拡張
b.subtilisおよびeの分析。 大腸菌は、細菌ゲノムの広範な調査は、これらのゲノムにおける減衰とantitermination調節の予測と調節のこれらのメカニズムの進化と分布の特徴付けの両方に有 この調査では、進化スペクトル全体の幅広い分布に基づいて、完成したゲノムが選択されました（表3）。 これらのゲノムの各々の遺伝子間領域を、ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＥと同じ方法およびフィルターを用いて分析した。 大腸菌および予測された減衰および抗終端ターミネータフォールドも同様に得られた。
表3に示すように、調査されたゲノムにおける推定減衰およ これらは、結核菌の5からclostridium acetobutylicumの275までの範囲である（表3）。 転写単位の末端における標準的な転写終止部位を予測する以前の試みは、同様の結果を与える。 興味深いことに、標準的な転写ターミネーターの結果は我々のものと相関している。 Ermolaeva etで発見されたように。 転写ユニットの末端に標準的なターミネーターを持つal（本稿では、Orfの末端にターミネーターを研究し、上流領域をターゲットにしなかったので、可能な減衰器をフィルタリングアウト）、我々の調査で減衰および抗ターミネーショ radioduransおよびb.subtilisおよびH.pyloriおよびm.tuberculosis（彼らの調査で報告されたゲノム）のようなゲノムの発生の最も低い数。
一見すると、これは多くのゲノムが標準的な転写終結に同じ終結機構を使用せず、調節に減衰または反終結を使用しないことを示唆しているよう これは、いくつかのゲノムではそうである可能性が高いです。 しかし、上流遺伝子間領域の数を予測部位の数に対してプロットすると、強い正の相関が示されます（図4）。 ゲノムが持つ遺伝子と遺伝子間領域の数が少ないほど、予測されるターミネーター（標準転写ターミネーターと減衰/抗ターミネーター調節ターミネーターの両方）の発生が低くな これは、多くのゲノムにおける標準的な終結と調節的終結の両方の数が低いことは、ゲノムサイズの大幅な減少と調節オペロンの数の減少によるものであり、必ずしも終結と調節の異なるメカニズムに依存するものではないことを示している。
調査されたすべての26ゲノムにおける推定減衰および抗終末部位の数対遺伝子間領域の数のグラフ。 既知の減衰または抗終末を有するいくつかのゲノムは、結核菌および古細菌であるように比較のために標識されている。 破線は指数関数的なトレンドラインです。
図4、結核菌に見られる推定ターミネータの予想数よりもはるかに低い明確な外れ値があります。 このゲノムは、そのサイズと遺伝子間領域の数によって示唆されるよりも、推定される減衰および抗終末部位の発生がはるかに低い。 Unniraman et alによる最近の論文。 結核菌は、他のゲノムに必要なポリU尾を持たないターミネーター構造を利用する異なる終結機構を使用していると結論づけている。 したがって、遺伝子間領域の数に関連してターミネーター構造を含むポリ-Uの数が減少することは、結核菌が異なるターミネーター機構に依存することによっ これは必ずしも結核菌に減衰または抗終末型規制がないことを証明するものではありません。 しかし、このゲノムにおける標準的な終結機構の喪失は、結核菌における減衰または抗終末を排除しなければ減少したか、あるいはMを利用するこのゲノムにおいて減衰のような機構が存在する可能性があることを示している。 結核非標準ターミネーター。
調査された25のゲノムの他のすべては推定減衰またはantitermination調節部位を持っています。 M.genitaliumで見つかった予測減衰またはantiterminationサイトの最小数でさえ、可能な調節性遺伝子間領域のかなりの割合であり、低い数は、このゲノムの比較的小さいサ これらの結果は，少数の例外を除いて，原核生物における減衰と抗終末調節は，おそらくユビキタスな調節機構であることを示唆している。
ゲノムサイズと減衰
ゲノムのGC含量をランダムにシャッフルされた配列に基づいて予測減衰器の数と比較すると、GC含量は予測減衰器の数 図5aでは、私たちの26ゲノムのランダムにシャッフルされた遺伝子間配列からの折り目は、遺伝子間領域の数に関連して遺伝子間領域あたりのフィ フィルタリングされた折り目の数が完全にランダムであった場合、領域の数に関連して、領域あたりのサイトの比較的一定の数があるはずです。 図5aに示すように、これは完全には当てはまりません。 ランダムにシャッフルされた配列から得られた領域あたりの濾過された折り目の数は、ゲノムのGC含量に依存する。 低GC含量ゲノムは、約50％のGC含量のゲノムよりもわずかに高いフォールド数を有し、高GC含量ゲノムは両方よりもはるかに低い数を有する。 これは、ポリUランを含むstemループ構造のためにフィルタリングされたランダム配列から期待されます。
ゲノムサイズと規制。 (a)26個のゲノムの遺伝子間配列をランダムにシャッフルし、折り畳まれ、推定される”減衰器”を得るために報告された方法を用いて濾過した。 遺伝子間領域あたりのこれらのシャッフルおよび濾過された折り目の数は、遺伝子間領域の数に対して各ゲノムについてプロットされた。 相関は、ランダムであれば、一定のままであり、ゲノムサイズとは無関係であるべきである。 青い球は私達の調査のproteobacteriaおよびBacillis種を表し、ベージュはarchaeabacteriaであり、残りは緑である。 球はゲノムのGC含量に比例した大きさであり、GC含量は各球内で標識される。 遺伝子間領域あたりのランダムなフォールドの数は、ポリ-Uランによるフォールドのフィルタリングから期待されるように、GC含量の関数である。 既知の減衰または抗終端を有するゲノムは、ポリ-Uランが終了している減衰器を使用しないことが知られているゲノムと同様に標識される。 （b）22ゲノムの遺伝子間配列を折り畳まれ、可能な減衰器と減衰またはantitermination規制の指標のためにフィルタリングされました。 遺伝子間領域あたりのこれらの予測された減衰器の数は、ゲノム中の遺伝子間領域の数と比較される。 ランダムにシャッフルされた配列の折り目とは対照的に、減衰の頻度の最も強い決定はゲノムサイズである（遺伝子間領域の数とゲノムサイズは強 色および分類は5aのと同じです。結核菌のGC含有量を考慮しても、他の高GCゲノムと比較して予測される減衰器の数が減少しています（図5b）。 実際、図5b（実際の遺伝子間配列の予測された減衰器）は、遺伝子間領域あたりの予測された減衰器の数の最も強い決定は、GC含量ではなく、むしろゲノ 一般に、より大きなゲノムは、予測される減衰器の絶対数が多いだけでなく、領域ごとに予測される減衰器の発生が大きい。 GC含量が二つのゲノムで等しい場合、より大きなゲノムは、遺伝子間領域ごとに予測される減衰器の数が多い可能性が高い。 これまでの報告では、調節タンパク質において同様の現象が示唆されており、大きなゲノムは、調節モチーフを含むタンパク質をコードする遺伝子の総数の割合が大きいようである。 興味深いことに、古細菌と高GC含量のゲノムを割り引くと、約1500の遺伝子間領域のゲノムは、ゲノム内の調節減衰器の頻度が増加する閾値であるよう
グラム陽性菌における減衰器の分布と保存
グラム陽性菌（b.subtilis、B.halodurans、L.innocua、s.aureus、C.acetobutylicum、L.lactis、およびs.pneumoniae）の七つのゲノムは、減衰ターミネーターがオルソログの前 B.subtilisおよび他の六つのゲノムにおけるそれらのオルソログで調節されることが知られている遺伝子の予測された減衰ターミネーターの数は、表4に記載さ ゲノムは，これらのゲノム間で共有されているオルソログのアミノ酸配列によって計算されたｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからの系統発生距離によってソートされる。 B.subtilisに最も近いものはB.haloduransであり、サイトあたりのアミノ酸置換の平均数は0.238であり、最も遠いものはS.pneumoniaeであり、サイトあたりのアミノ酸置換の平均数は0.422である。 表4に記載されている42個の遺伝子については、他のゲノムに見られるオルソログの数はゲノムによってほとんど変化しない：オルソログの最 これは主に、これらの42の遺伝子がアミノアシルtRNA合成などのいくつかの基本的な機能を運ぶためです。 一方、予測される減衰終端構造の数は、Bでは大きく異なります。 halodurans、22のorthologous遺伝子だけ4つのorthologous遺伝子がS.のpneumoniaeの予測された構造を持っているが、減少の終了の構造を予測しました。 これは、減衰による調節の不在または存在が、遺伝子またはオペロンの存在よりもはるかに弱く保存されていることを示している。
同じ傾向が既知のもの以外の予測された減衰終止構造にも当てはまる（表5）。 オーソロガス遺伝子の上流に予測された減衰器構造を含む少なくとも一つの他のゲノムを有する105のオーソロガス遺伝子群がある。 Bの減衰器を予測しているオルソログに限定する。 枯草（35グループ）、b.subtilisの減衰またはantterminationによって調節されることが知られている遺伝子の共有オルソログの最高と最低の数は、それぞれ28（L.innocua）と18（s.pneumoniae）で しかし、予測される減衰終端構造の数は、より多く変化します。 B.haloduransには13の遺伝子があり、これはb.subtilisに最も近い種であるが、s.pneumoniaeには2つの遺伝子しか予測されていない。
全体として減衰器の保存は弱いが、予測された減衰終止構造およびその下流遺伝子の順序はいくつかのグループで保存されている。遺伝子の。 そのような例の1つはinfC-rpml-rplTオペロンです（図6a）。 Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＩＮＦＣの上流領域では、減衰終端構造は予測されない（表５）。 BLASTによるこの領域を詳しく見ると、infCのN末端が27塩基で予測されていることが明らかになった。 上流の遺伝子間領域に27塩基を添加することにより、我々はまた、s.pneumoniaeでポリU残基が続く安定したステムループ構造を発見した（図6b）。 しかし、この例でさえ、ステムループ構造の相対的な位置と配列保存には種間でかなりの違いがあります。 さらに、系統発生的に最も近い対の間でさえ、b.subtilisとB.subtilisとB.subtilisとb.subtilis。 haloduransでは、茎の終わりからinfCの開始コドンまでの距離はそれぞれ69塩基と37塩基であり、茎に見られる共通のセグメントのみがGUGUGGGN{x}CCCACACである（b.subtilisではx=12、B.haloduransではx=9）。 全ゲノムの中で，茎領域には弱い類似性ＧＹＧＧ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのＧＡＣＧＧ）のみが存在する。
推定infC-rpmI-rplTオペロンの上流領域における予測減衰終端構造。 （a）遺伝子の順序。 遺伝子間領域のみをスケールするように描画し、遺伝子間領域の長さを線の下に与えます。 Orthologous遺伝子は同じ色で示されます。 仮説的遺伝子および他の非オーソロガス遺伝子は、それぞれ「ｈｙｐ」およびそれらの遺伝子Ｉｄによって示される。 ゲノムの略語：Ｂｓ，ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｂ Ｈ，Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ；Ｌｉ，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ；ｓａ，ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；Ｃ Ａ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；Ｌｌ，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ；Ｓｐ，ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ。 (b)予測された減衰終端構造。 塩基対は、塩基コードの間に赤い点で示される。 塩基番号付けは、下流遺伝子の開始コドンからの距離を示す。 ポリ-私たちはちょうどステム-ループ構造の流れの下に緑色に着色されています。 弱く保存されたセグメントは赤色で着色されています。 Genomesの略号は、（ａ）と同じである。
予測された減衰終端構造の保存は、nusA遺伝子を含む可能性のあるオペロンの上流領域でも観察される（図7a）。 7つのゲノムのうち4つは、仮説的なタンパク質（b.subtilisのylxS）の上流に予測された減衰器構造を含んでいます。 これらの構造はフィルターを通過しないが、ステムループ構造は残りの3つのゲノムにも見られる。 下流遺伝子および配列自体の転写開始部位への構造の位置も、この例では有意に変化する。 これらのｓｔｅｍ配列において、セグメントＧＵＧＧＧ（Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおけるＧＡＧＣＧおよびｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおけるＧＡＧＧＣ）は、ＮＵＳＡ遺伝子を含む予測オペロン中に保存される（図７ｂ）。 興味深いことに、5塩基セグメントは、infCの上流に位置するステムループ構造のセグメントと同一または非常に類似しています（図6b）。 これら二つのオペロンの遺伝子をコードする蛋白質は転写に関与している。 Ｉｎｆｃ-ｒｐｍｉ-ｒｐｌｔオペロンとｎｕｓａを含むオペロンの予測減衰ターミネータ構造におけるシーケンスセグメントの保存は，ステムループ構造を認識する共通の調節機構が存在し，これが両方のオペロンを同じように調節することを示唆した。
ylxS遺伝子の上流領域における減衰終了構造を予測しました。 （a）遺伝子の順序。 統計的有意性を有する予測されたステムループ構造は青色で示され、フィルタを通過しないか、または有意性が低い他の構造は赤色で示される。 その他の説明については、図6aの凡例を参照してください。(b)予測された減衰終端構造。 説明については、図6bの凡例を参照してください。
プロテオバクテリアにおける減衰器の分布と保存
減衰器の保存のいくつかの側面は、グラム陽性菌の分析から まず、減衰またはantitermination規制の分布は、グラム陽性baceria全体でよく保存されていないし、さらに、保存された規制システムでも、シーケンスと構造の保存が弱いです。 同じことがプロテオバクテリアにも当てはまります。 Eの14個の遺伝子のうち、 大腸菌（表5a参照）は、減衰または抗終末によって調節されることが知られているが、他の四つのプロテオバクテリアゲノムのすべてにおいて上流オルソログを予測する減衰器を有さない。 六つのアッテネーターは、他の四つのゲノムの少なくとも一つで上流オルソログを予測しています。 三つは、他の四つのゲノムすべてにオルソログを有する遺伝子であるが、これらは予測された減衰器を有さない。 大腸菌の残りの五つの遺伝子は、他のゲノムに既知のオルソログがないか、オルソログがむらのある分布を持ち、予測された減衰器がない。 手での綿密な検査は、この結論を確認します。 表５ｂは、類似の減衰器が別のゲノムのオルソログについて予測される、プロテオバクテリアのガンマ部の５つのゲノムの各々における全ての予測された減衰器のリストである。 この表に示すように、減衰とantiterminationは、プロテオバクテリアゲノムの類似オペロンにおける調節のメカニズムとして不十分に保存されているように見え アッテネーターを予測したこれら５つのゲノム中の合計４ ７ ５個の遺伝子およびそれらのオルソログのうち、３ ６個だけが、２つ以上のゲノムの上流オルソログを共有している（表３、５ａおよび５ｂ）。
特定のシステムに関する以前の研究は、大腸菌のいくつかのオペロンにおける減衰とantitermination調節は、ガンマ分裂プロテオバクテ 大腸菌の調節rpsJオペロンとtrpEとpheAオペロンはむらの分布を持っていることが示されており、プロテオバクテリア全体で弱く保存されています。 表2、5aおよび5bに示すように、我々は広範囲にプロテオバクテリアのほとんどのそのようなシステムに減衰およびantiterminationのこの分析を拡張することが 減衰器とレギュレーションの低シーケンス保存の例を図8に示します。 図8aでは、より保存された減衰器の一つがhisGオペロンの減衰器の一つであることが示されています。 このオペロンと調節機構はよく大腸菌で特徴付けられ、我々の分析は、v.コレラとインフルエンザ菌における減衰調節の同様のメカニズムを予測し 予測された減衰器は、保存された位置（hisG遺伝子の約40-50bp上流の開始コドンで）、およびstem配列を有する。 周囲の遺伝子間領域を整列させることはできないが、v.choleraeおよびH. インフルエンザ菌は、大腸菌の減衰調節機構の特徴であるヒスチジンの実行と可能なアミノ酸リーダー配列を持っています。 Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｕｓおよびＸ．ｆａｓｔｉｄｉｏｓａの他の三つのガンマサブディビジョンプロバクテリアゲノムには予測された減衰器は見られなかった。 P.aeruginosaではhisGオルソログの上流の遺伝子間領域は長さがわずか17bpであり、X.fastidousではオルソログ遺伝子は上流のORFと重複し、類似のn.meningitidus遺伝子間領域は十分な長さであるが、減衰器は予測されていない。
Predicted attenuation termination structure in upstream region of HisG gene in E. coli. (a) Order of genes. Predicted stem-loop structures with statistical significance are indicated in blue. For the other explanation, see legend to figure 6a. Abbreviations for genomes: Ec, Escherichia coli; Hi, Haemophilus influenzae; Vc, Vibrio cholerae; Pa, Pseudomonas aeruginosa; Xf, Xylella fastidiosa; Nm, Neisseria meningitidis. (b)予測された減衰終端構造。 説明については、図6bの凡例を参照してください。