“酵素単位”、”酵素活性”、および”特定の酵素活性”の意味には、多くの場合、多くの混乱があります。 このガイドでは、これらの重要な概念を簡単な言葉で説明し、酵素アッセイの設計と”線形範囲”での操作の重要性について説明します。 また、標準曲線と、x軸に製品の濃度または絶対量をプロットする必要があるかどうかについても検討します。 アッセイ制御を設定し、ブランクを減算する上でいくつかのヒントが議論されています。 最後に，酵素活性値の計算方法を説明し，速度論的方程式の簡単な概要を示した。
酵素単位の定義
誰もが同じ単位定義を使用した場合、酵素学はそれほど複雑ではありません。 標準的な単位の定義は以下の通りである：
1単位（U）は、1分あたりの基質の1umolの反応を触媒する酵素の量である（定義A）。
1単位（U）は、1分あたりの基質の1umolの反応を触媒する酵素の量である（定義A）。
ほとんどのR&D設定では、基質の1umolは実際にはかなり多くの材料であり、単位の分数で量を表現しないようにするために他の定義 以下の非標準的な定義が一般的に使用されている：
1単位（U）は、1分あたりの基質の1nmolの反応を触媒する酵素の量である（定義B）。
1単位（U）は、1分あたりの基質の1nmolの反応を触媒する酵素の量である。
定義の変更は、定義Aによる酵素の1単位、すなわち定義Bによる1000単位に相当する単位の記載された数に大きな影響を与えることに注意してくまた、単位がどのように定義されているかにかかわらず、単に単位の千分の一を意味するミリ単位（またはmU）として表される酵素単位を見ることがで
明らかに、チューブ内の酵素の実際の量は、単に単位定義を変更することによって変更されるのではなく、異なるサプライヤーからのサンプルの活 単位定義が提供されている限り、指定された単位数を1分あたりのnmolに変換することができ、これは明確であり、有効な比較を行うことができます。
あなた自身の仕事を明確にするために、’nmol per min’（または’umol per min’）を使用することを好むかもしれませんが、一定の繰り返しが必要な場合は、はるかに短
「酵素活性」とは何か
活性は、mlあたりの単位（U/ml）、言い換えればmlあたりの分あたりnmol（単位定義Bが採用されている場合）で引用されています。
活性は、mlあたりの単位（U/ml）、すなわちmlあたりの分あたりnmol（単位定義Bが採用されている場合）である。 したがって、単位で表現された活動値は、単位定義Aから単位定義Bに切り替わると、幻想的な1000倍の”増加”の対象となります。 再び、活性がml当たりの単位ではなくml当たりの分当たりのnmolで表される場合、混乱は生じない。活性は濃度に関連するので、酵素の2つのバイアルは同じ数の単位（合計）を含むことができるが、異なる活性（濃度）を有することになる。
活性は濃度に関
特異的な酵素活性とは何ですか？
特定の酵素活性（通常は単に「比活性」と記載される）は、mlあたりの酵素単位の数をmg/mlのタンパク質の濃度で割ったものです。
特定の酵素 したがって、比活性値は、単位／ｍｇまたはｎｍｏｌ／分／ｍｇ（単位定義Ｂが適用される場合）として引用される。
比活性は、酵素純度の重要な尺度であり、純粋な酵素の異なるバッチの値は、通常の実験誤差内で同じでなければなりません。
比活性は、酵素純度
酵素溶液の連続希釈は、異なる酵素活性値を有するが、比活性を計算する際に分子（単位/ml）と分母（mg/ml）がサンプル希釈によって等しく影響される
比活性は活性とは非常に異なるが、比活性の計算はそれにもかかわらず活性値に依存しているため、記載された比活性値も酵素単位の定義に依存 期待比活性値を下回るバッチには、変性した不純物または酵素分子が含まれている可能性があります。酵素活性に影響を与える要因
このセクションでは、一つの酵素が異なるラボで異なる測定活性値を有する可能性がある理由を説明します。
これは、測定された活動の実際の違いを意味し、異なる単位定義の使用によって引き起こされる明らかな違いではありません。
アッセイが実施される条件は、報告された活性値に影響を及ぼす。
例えば、アッセイは、典型的には20-37℃の間の温度で実施される。一般的に言えば、酵素は37℃で20℃よりも活性であろう。
酵素単位の定義は、より良いように表現されるであろう：
1単位（U）は、標準的な条件下で毎分1nmolの基質の反応を触媒する酵素の量である。残念ながら、「標準条件」という用語は解釈が可能であり、少なくともR&d環境では、異なるユーザー設定がある可能性があります。&d環境では、「標準条件」という用語は解釈が可能であり、異なるユーザー設定がある可能性があります。 従って10の研究所は酵素の同じ解決のための異なった活動を（かなり正しく）計算するかもしれません。 ほとんどの研究室は自身の”標準条件”を確立し、各々の新しいバッチを内部的に点検する。 臨床設定で’標準的な条件’は明示的に定義され、すべての実験室は同一の試金を動かすように要求される。
アッセイの開発と線形範囲の重要性
アッセイを開発する際には、酵素の活性値（単位/ml）が最も重要なパラメータです。 これはあなたが加える容積（すなわち単位の数）がプロダクトに変えられる基質の量を定めるのである。 覚えておいてください、1単位は1分あたりの基質の1nmolの変換を触媒します（定義B）。
報告された単位/mlは、追加する酵素の量の大まかなアイデアを与えるかもしれませんが、活性値はあなたと同じテストで決定されていない可能性があるため、酵素の連続希釈（最初はログ希釈など）を準備し、各希釈の一定量をテストするのが普通です。 アッセイ信号（変換された基質の量に関連する）に応じて、適切な希釈で帰宅するために第二の実験が必要となることがある。”最高の”希釈は正確には何ですか？
これに答えるためには、アッセイ設計の最も重要な側面、すなわち線形範囲について考える必要があります。 定量的な作業は、アッセイ信号（しばしば吸光度）対酵素濃度のプロットが線形である範囲で動作することが重要である。 他の制限因子が存在しないと仮定すると、ほとんどのアッセイは、基質変換の程度が１ ５％未満である場合に線形である。 試金の時間（例えば30分）および温度（例えば25oc）の固定によって転換のある程度は1つの変数すなわち加えられる酵素の単位の数の調節によって単
これは図1にグラフィカルに示されており、希釈は逆数で表されています（すなわち、x軸上で1/10=0.1の希釈）。 あなた自身のプロットは形および線形範囲で異なるかもしれないが、非常に高い酵素の集中で確実に試金信号は加えられる酵素の量に比例して増
図1のアッセイは、光学密度（OD）2.5まで線形であり、0.02（酵素の1/50希釈）の希釈係数は、大きなシグナル（-1.5）を与え、線形範囲の中央にあるため、アッ 0.04と0.12の間の範囲の希釈因子の結果に基づく計算（すなわち、傾きが減少した領域）は、アッセイ信号の大きさを明らかに制限しているため、酵素活性の真のレベルを過小評価する。
多くの要因は線形範囲を限るために作動するかもしれ、範囲は試金から試金に変わります。
非直線性の一般的な理由の1つは、基板の過度の消費であり、反応速度が低下する可能性がありますが、プレートリーダー（または使用される測定装置）の光学部品の制限も重要である可能性があります。 例えばほとんどの版の読者は確実に3の上の吸光度の価値を測定できないし、この限定はプロダクトに変えられた基質のパーセントにもかかわらず適
図1。 吸光度対酵素の量
このガイドでは特に説明していませんが、特に非常に希薄であり、いくつかの反応の生成物が酵素を阻害する可能性がある場合、酵素は時間の経過とともに変性する可能性があることにも注意する必要があります。 実際に、非線形挙動の他の考えられる理由があるが、上記のように酵素の連続希釈を使用して試行錯誤によって線形範囲を見つけることは通常比較的容易である。
アッセイ時間と温度
これらのパラメータは、基質変換の速度に影響を与えるため、線形範囲にも影響を与える可能性があります。
例えば、アッセイは、１ ５分後に直線的であり得るが、６ ０分後には、あまりにも多くの基質が消費されている可能性がある。 このような状況では、60分間アッセイを実行するために酵素の量を減らす必要があります。 反応速度にも影響する可能性があるため、アッセイ温度にも同じ考慮事項が適用されます。
ほとんどの人は、15分から60分の間のどこかのアッセイ時間を採用しています。 反応の停止のわずかな遅延が活性の計算に重大な誤差をもたらすので、非常に短い時間（例えば2分）は回避されるべきである。 冷蔵庫や冷凍庫に保管されている試薬が使用前に正しい温度に平衡化されていることを確認することが重要であり、比較的短いアッセイ時間があ
アッセイボリューム/感度
実用的な観点からは、アッセイボリュームは、アッセイに使用する消耗品（キュベット、チューブ、マイクロプレートなど）によっ ほとんどの酵素アッセイのシグナルはアッセイ量に比例し、アッセイを小型化しようとする（例えば、試薬を節約する）試みは、通常、より低いシグナルにつ 但し、吸光度の試金は頻繁に例外であり、3mlキュベットからの1mlマイクロキュベットへのスイッチは、例えば、キュベットの幅（道の長さ）がまだ1cm（すな 光はまだ同じ”長さ”の液体を通過する）。 これは、吸光度が試料の体積ではなく経路の長さに比例するためです。
マイクロプレート吸光度アッセイでは、パス長は液体の深さに等しく、ウェルの直径を小さくし、液体の一定の深さを維持することにより、信号を損 例えば、96の井戸の版はサンプルの200ulを容易に収容できますが50ul試金の容積と96井戸の版のサンプルの50ulと見られるそれ上の道の長さを増
連続アッセイ（時間の経過とともに製品の外観を測定する）
ほとんどのアッセイは、一定期間（エンドポイントアッセイ）のために行 しかし、連続アッセイでは、生成物の外観（あまり一般的ではない基質の消費）が連続的に記録される（例えば、以下のような）。 チャートレコーダーによる）。 同じ基本的なルールが適用されます;酵素の一定量のための信号対時間のプロットは線形であるべきであり、酵素の量が倍増すれば率は倍増するべき アッセイが線形範囲で操作されている限り、適切に希釈された「未知数」の活性は、一連の標準で測定された反応の初期速度から正確に決定することがどのような基質濃度を使用すればよいですか？
基質の濃度は反応速度に影響しますが、”正しい”濃度を選択する際に考慮すべきいくつかの要因があります。
基質の濃度は反応速度に影響します。
実用的な観点から、一つの重要な考慮事項は、測定可能なアッセイ信号を与えるために生成されなければならない製品の量である。 酵素反応の速度は、基質の約15％以上が加水分解されたときに低下する可能性が高いので、基質の初期濃度は、一般に、許容されるアッセイ信号を与える
もう一つの考慮事項は、基板のKmです。 より多くの基板を追加すると、一般的に、より高い活性値が表示されることを意味しますが、関係は線形ではなく、基板のコストを考慮する必要があ この時点で、古典的なミカエリス-メンテン方程式を導入することはおそらく有用である：
v=(Vmax S)/(Km+S)。…………… Eqn. (1)
ここで、vは速度であり、Vmaxは可能な最大速度であり、Sは基質濃度であり、Kmは半分の最大活性を与える基質濃度に等しい。
ここで、vは速度であり、Vmaxは可能な最大速度であり、Sは基質濃度であり、Kmは最大活性を与える。 この方程式の導出とその基礎となる仮定は、酵素動態に関する任意のテキストブックに記載されています。 酵素反応の速度を計算するのではなく測定するのが普通ですが、アッセイ設計の目的のために基礎となる原理を理解することは有用です。
ミカエリス-メンテン方程式は、Kmがわかっている場合に基質の適切な濃度を選択するのに役立つという点で有用です。
ミカエリス-メンテン方程式は、Kmが知られている場合に基質の適切な濃度S=Kmのとき、v=(Vmax S)/2S、すなわちv/Vmax=S/2S=λである。言い換えると、酵素はS=Kmのときに可能な最大速度の50％で動作します。
言い換えると、酵素はS=Kmのときに可能な最大速度の50％で動作します。
式1にS=10とKm=1の値を代入すると、基質濃度を10倍にすると、酵素は50％ではなく最大90％で動作することがわかります。
式1に代入すると、s=10とKm=1の値が表示されます。 明らかにこれは高いですが、10倍高くはありません。
非常に高濃度の基質では、式1のKmは数値的に重要ではなく、測定された速度はVmaxに等しくなります。
多くのアッセイは、Km値またはその周辺の基質濃度で実行されますが、Kmが非常に高い場合、そのような高濃度の基質を使用することはできない 費用または限られた容解性の理由のために）。いくつかの状況では、比較的低い濃度の基質を使用することさえ推奨されるかもしれない。
例えば、医薬品の創薬において、非常に高い基質濃度の使用は、競合酵素阻害剤（競合阻害剤は、基質と同じ部位に結合する）を同定することをより困難に
アッセイが測定可能な信号を持ち、線形範囲で操作でき、他のアッセイ目的（コスト、時間など）を満たすことができるように、さまざまな要因のバラン
標準曲線
酵素活性を計算する場合は、常に標準曲線が必要です。 相対的な活動値のみに関心がある場合は必須ではありません。標準曲線は、適切な濃度範囲にわたる反応生成物の標準溶液を用いてアッセイ信号を測定することによって構築される。
標準曲線は、反応生成物の標準溶液を用いてアッセイ信号を測定することによって構築される。 理想的には、すべての実験に対して標準曲線を実行する必要がありますが、標準曲線が再現性が高い場合は、定期的に実行することをお勧めします。
典型的な標準曲線を下の図2に示します。 これは、ＡＴＰがａｄｐおよびＰｉ（無機リン酸塩）に加水分解されるＡｔｐアーゼアッセイのための標準曲線である。
図2。 Piの標準曲線
リン酸塩は、リン酸塩の存在下で色を変化させる色素結合試薬によって検出される。 但し、このテストの細目はここに重要ではない;使用される検出のプロダクトまたは方法の性質が、試金のプロダクトの量の信号の依存を示す標準的なカーブは組み立てられなければならないものは何でも。 「曲線」（理想的には直線である）は、ｘ軸上の切片を読み取ることによって、未知の活性を有する試料中に生成される生成物の量、すなわち吸光度値から （ほとんどのグラフィカルソフトウェアパッケージは、yの測定値からxの値を自動的に計算します）。 その後、アクティビティの量を計算することができます（後述）。X軸に濃度または絶対量をプロットしますか？
X軸に濃度または絶対量をプロットしますか？
ここには単一の正解はなく、どちらのアプローチを使用する可能性は、アクティビティ値を計算するときに混乱を引き起こす可能性があります。 たとえば、x軸に製品のnmolをプロットすることは、アクティビティ値を計算する必要がある場合に非常に便利です（activity=nmol per min per mlを覚えておいてください）。 しかし、実験用試薬は通常、既知の濃度で調製され、これらの値をx軸にプロットする方が簡単であることが多い。 ただし、酵素の活性（または比活性）を計算するときは、x軸上の濃度を生成物のnmolesの数に変換することを覚えておく必要があります。 その理由は分かりやすいです: 標準溶液の50ulおよび100ul容積は同じ集中にありますが、より大きい容積はプロダクトの量を二度含んでいます。 一般的に、活性を計算するのと同じ方法が常に使用されるように、1つのアプローチ（すなわち、生成物の絶対量または濃度のいずれかをプロットする）
コントロールと’空白’データの減算
計算におけるコントロールデータの正しい使用があるように、適切なコントロールは、定量的な作業のために
コントロールは、アッセイ信号のどのくらいが酵素の作用によるものであり、どのくらい他の理由で発生するかを（間接的に）教えてくれます。
コントロールは、アッセイシグナルの量を教えてくれます。 “偽”信号の一般的なソースは、（多くの場合、製品で汚染されている可能性があります）基板です。 他のアッセイ成分はまた、成分の性質およびアッセイのタイプに応じて小さな信号を生じさせることができる。 コントロールの目的は、酵素の作用に関連していない総信号の要素を（減算によって）除去できるようにすることです。 試金がうまく設計され、試金の試薬が良質なら対照の処置は通常かなり簡単です。
いくつかの一般的なガイドラインを以下に示します。
無機リン酸塩を検出するための比色アッセイに戻ると、適切なコントロールで容易に検出されるいくつかの潜在的な問題を強調することができます。
リン酸塩検出試薬は、測定に使用される波長（約650nm）で約0.08ウェルプレートで96の低い読み取り値を与えます。
以下のアッセイ/コントロール（仮説的なアッセイ状況では括弧内の測定値）を設定することができます。
- すべてのアッセイ成分マイナス酵素（0.5）
- 酵素それ自身（0.1）
- 酵素プラス他のすべての成分（1.8）
明らかに1.8のアッセイ信号は、基質上の酵素の作用のみによるものではありません。
任意の酵素アッセイのために、キーコントロール（A）は、酵素を除外する（および緩衝液に置き換える）ことです。 これにより、少量の生成物を含む可能性のある基質を含む、他のすべてのアッセイ成分のバックグラウンドシグナルがグループとして得られます。 このコントロールは、酵素の背景信号を教えてくれませんが、明らかにあなたはコントロールとして基質に酵素を追加することはできません！ ほとんどの試金で酵素は試金の使用の前にかなり薄くなるので信号を与えません。 これは、上記のBのように簡単に確認できます。
サンプルA（上記）のデータは、混合物が無機リン酸塩で汚染されていることを示唆している。
その後、個々のコンポーネントをチェックして、問題の原因を特定することができます。 この状況は、基質がしばしば不安定であり、部分的に加水分解されていくつかの無機リン酸塩を与えるので、Atpaseおよび他のリン酸生成酵素のアッセイ
いくつかのコンポーネントが偽の信号を与える場合、生データを修正するのは厄介なことがあります。 上記のサンプルCの’補正された’値は、1.2のように見えることがあります(つまり、1.8 – 0.5 – 0.1）しかし、厳密に言えば、これは間違っています。 検出の試薬と試金の版がおよそ0.08の背景信号を与えることを覚えなさい、従って制御Aのための信号のほとんどのもとは版や検出の試薬のプラ 同じ小さい信号はまた酵素制御のための価値の内で隠されなければなりません。 したがって、上記の修正では、この隠された空白を2回減算しました。あなたは常にアッセイデータからコントロールを減算する必要があり、すべての物質（酵素を除く）を組み合わせて単一の値を減算することが好ましい。
このアプローチが取られる場合、標準曲線は同じ方法で処理され、対照値が減算される（すなわち、生成物の非存在下で得られる値、すなわち、上で議論され したがって、減算されたアッセイデータも減算された標準曲線も、プレート/アッセイ試薬によって引き起こされる潜在的に誤解を招く背景信号を含
最後に、我々が見てきたように、偽の信号は、適切なコントロールで簡単に検出されますが、良い品質のデータを取得するための最良の戦略は、コントロールの値が低くなるように、低い背景を持つ試薬を使用することです。 また、任意の背景信号よりもはるかに高いアッセイ信号（酵素による）を生成することも有用である。 理想的には、信号対背景比は、正確な定量的作業のために少なくとも5であり、好ましくは10以上でなければならない。
アクティビティ値の計算
生のアッセイデータから段階的にバック計算すると、これは非常に簡単に理解できます。 例えば、酵素反応で10nmolの生成物を生成したとしましょう（すなわち、生成物の絶対量に対するシグナルの標準曲線から決定される）。 活性はml当たりの分当たりnmolとして表されるので、活性を計算するためには、時間と体積、そしておそらく明らかではない酵素の量と希釈を考慮すアッセイの長さが10分である場合、上記の例における1分あたりのnmolの数は1である。
アッセイの長さが10分である場合、上記の例におけるnmolの数は1 アッセイ容積が200ulの場合、mlあたり1分あたりnmolを得るために5（すなわち1000/200）を掛ける必要があります。
(ステップ2)
この値は、アッセイのセットアップに使用された酵素のサンプルではなく、アッセイにおける酵素の活性に関連する。
この値は、アッ 酵素の元のサンプル中の酵素活性を決定するためには、いくつかのさらなる補正因子が必要である。酵素は、使用前に希釈されていてもよく、アッセイに存在する他の成分によってさらに希釈されなければならない。
酵素は、使用前に希釈されていてもよい。
試金（合計の200ul）が酵素の20ulから成り、20ulサンプルが加えられる前に酵素が1/100前薄くされれば、元の酵素の解決の酵素の活動を得るために私達が10（これまでのところ、これは比較的簡単です。
これまでのところ、これは比較的簡単です。 しかし、濃度は標準曲線のx軸にプロットされることが多いことを前述しました。 したがって、値はミリモルではなくmM単位で表される可能性があり、標準曲線を検査するだけでミリモルの数を決定することはできません。
mMはリットル当たりのmmolesを意味するので、1Lの暗黙の容積と実際のアッセイ容積との間に不一致がある。 従って私達に10mmプロダクトがあり、試金の容積が200ulなら、私達はプロダクトのmmolesの数を得るために5000で割る必要があります。ここでは、5000で割ると、上記で必要とされていた乗算演算の一部が相殺されることに気付くかもしれません。
ここでは、5000で割ると、上記で必要とされてい 確かに、補正係数が相殺されるのは非常に正常です。 たとえば、1/10希釈酵素を使用した10分間のアッセイでは、10で除算して1分あたりnmolを取得し、後で10で乗算して希釈係数を補正します。
常に標準的なアッセイ条件を使用する場合（つまり、 あなたの標準）、あなたはあなたの活動値を計算するために、他の個々の補正係数のすべてを包含する単一のグローバル補正係数を標準曲線からの’x’値 最初の機会にのみ、個々の補正係数を特定する必要があります。
酵素阻害/薬物スクリーニング
これは、線形範囲で操作する必要が残っているが、活性値の計算は通常は関連しない酵素学の領域である; むしろ、試験物質の存在下および非存在下での相対反応速度（または生成物の相対量）が重要であり、ブランク減算アッセイデータを使用した単純な計算 ブランクを減算した後、形成された生成物の量は、被験物質の非存在下で得られた量の百分率（すなわち、１ ０ ０％）として表される。 質問されているので、これらのアッセイは、時には非常に低い信号対背景比で実行することができます-試験物質は反応を阻害しますか？
-はい/いいえの回答のみが必要です。
概要
このガイドは、うまくいけば、”酵素単位”、”酵素活性”と”特定の酵素活性”、および単位の定義と”線形範囲”の重要性の明確な説明を提供しています。 標準曲線のx軸に何をプロットするかの詳細は、ユーザーの好みの問題ですが、アクティビティを計算するときには注意が必要です。 アッセイ制御は重要ですが、高品質の試薬を使用することは、数学的アプローチを使用して背景を除去するよりも優れています。 定量的な作業には高いシグナル対バックグラウンド比が望ましく、アッセイ信号を増加させるために多くのパラメータを変化させることができる。 酵素活性値は、重要なアッセイ変数を識別するために段階的アプローチが使用される場合、容易に計算することができる。
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