重症ヒト免疫不全ウイルス感染患者における百日咳菌のグラム染色物質の直接遺伝子型解析とB.holmesiiからの識別による同定。 ユニークなrecA遺伝子制限酵素サイトを使用してholmesii

臨床標本からの細菌の同定は、主にin vitro培養および顕微鏡検査後の表現型特性評価を介して行われます。 しかし、直接グラム染色された調製物は、多くの生物を明らかにすることは珍しくありませんが、培養物は病原体を実証することができません。 これは、AIDSを持つ48歳の男性が肺コクシジオイド真菌症で入院した最近の臨床例で示されました。 しかし、彼の状態は改善されなかった。 かくたん試料は直接顕微鏡で多くのグラム陰性かん菌を示したが，培養上の病原体はなかった。 さらに，いくつかの血液培養では，従来の方法では種分化できなかった絶食性グラム陰性桿体を成長させた。

我々は、小さなサブユニットrRNA（16S rRNA）遺伝子を目的とした普遍的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いた遺伝子型法による二つの分離株の同定を試 しかし，呼吸標本からはグラム染色スライドのみが利用可能であった。 そこで，細菌ＤＮＡをグラム染色スライドから直接回収する新しい方法を開発した。 スライドは、従来の方法論によってグラム染色された（12）。 透明なガラススライドを試料で塗抹し、絶対メタノールで処理した（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ，Ｍｏ．）、続いて６ ５℃での熱固定および結晶バイオレット溶液での処理（Ｒｅｍｅｌ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓ．). スライドはさらにグラムヨウ素（Remel）で処理され、アルコール-アセトン溶液（3：1）で脱色され、サフラニン（Remel）でカウンターステインされた。 Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎｊ）を用いてスライドから浸漬油を最初に除去し、続いて１ ０ ０％エタノール中ですすいだ。 次いで、材料を、５ ０μ ｌのＰｕｒｅｇｅｎｅ−ＤＮＡ水和溶液（Ｇｅｎｔｒａ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）中に懸濁した、まっすぐなかみそり刃で廃棄した。）、vortexed、および10分間煮沸した。 血液分離物の分析のために、ＢＡＣＴＥＣボトルおよび固体培地上で増殖させたコロニーの両方からの材料を使用した。 ５ｍ Ｍ Ｍｇｃｌ２、各デオキシヌクレオシド三リン酸１ ０ ０μ Ｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．１ ５μ Ｍ（それぞれ）ユニバーサル１ ６Ｓ ｒＲＮＡプライマー１ １Ｅ（５’−ＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＴＧＡＣＧ−３’）および１ ３Ｂ（５’−ＴＣＣＧＧＧＣＣＣＴＴＧＣＡＴＡＡＧＴＧ−３’）（１ ５）。 ９ ４℃で５分間の変性ステップの後、９ ４℃で６ ０秒、５ ０℃で６ ０秒、および７ ２℃で９ ０秒のＰＣＲステップを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｇｅｎｅａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９ ６ ０ ０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ Ａ）において３ ０回繰り返した。). 生成物は、喀痰および血液の両方から得られた（図１ ０Ａ）。 1). これらをＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製した。、バレンシア、カリフォルニア州。Ｋｅｃｋ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏ ｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）でＤＮＡ配列決定を行った。 BLAST(1)による公開データベース(GenBank)とのその後の比較は、血液分離株をHelicobacter cinaediまたはHelicobacter rappiniとして同定した。 両方の生物は、免疫不全患者におけるbacteremiasに関連付けられています(9, 10, 13, 16, 17). 呼吸分離物のＰＣＲ産物は、ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｈｏｌｍｅｓｉｉの両方の１ ６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と一致し、これらは、増幅された領域において９ ９．

Bordetella呼吸分離株を特定し、遺伝子型解析の結果を検証するために、ユニークな制限酵素部位を含むrecA遺伝子（6、7）の一部を標的とした識別アッセイを開 百日咳菌の増幅（ＡＴＣＣ９ ３ ４ ０；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ． ３ｍ Ｍ Ｍｇｃｌ２および新たに設計された特異的プライマー（前方、５’−ＣＡＡＴＡＣＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧ−３’）を除いて、上記のようにして、Ｂ．ｈｏｌｍｅｓｉｉ（ＡＴＣＣ５ １ ５ ４ １）ＤＮＡならびに患者の喀痰グラム染色を行った。; ５’−ＴＧＡＴＧＴＣＧＡＡＣＴＣＧＧＣＣＴＧＣ−３’）を使用し、ＰＣＲステップ（９ ４℃で３ ０秒、５ ９℃で３ ０秒、および７ ２℃で６ ０秒）を４ ５回繰り返し、続いて７ ２℃で最終伸長ステップを行った。、ビバリー、マス。). Ｂ．ｈｏｌｍｅｓｉｉは二つのＮｃｉｉ部位を有するが，ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよび他のすべてのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｓｐｐがあるため，二つの生物を容易に区別することができた。 増幅された領域内に１つのＮｃｉｉ部位のみを有する。 その後、喀痰単離物を百日咳菌として同定した（図１ ０Ａ）。 ヒト免疫不全ウイルスに感染した患者における日和見肺病原体として報告されている（4、5）。

我々は次に、普遍的なプライマーを用いた臨床グラム染色製剤から直接生物の遺伝子型同定が実行可能で再現可能な方法であるかどうかを調べた。 固定のタイプ（熱、１ ０ ０％メタノール、および１ ０ ０％エタノール）および上記のようなグラム染色後の色素残渣の存在は、ＰＣＲに干渉しない。 痰の1,500CFU/μ lの検出限界（油浸フィールドあたり6-30生物）が発見され、これは他の報告（14）と同様である。 この知見のために、グラム染色または培養中の細菌のない三つのランダムな臨床喀痰サンプルをプールし、定義された量の大腸菌（ATCC25922）でスパイクし、固定 いくつかのランダムに選択された臨床サンプルを試験し、支配的な生物が顕微鏡上に表示されたとき、その同定は培養病原体と一致した（表1）。

我々の方法は、以前に説明したアッセイよりもいくつかの利点があります。 これまでの報告とは異なり、dnaは最初に喀痰から抽出され、種特異的プライマーが使用される(2, 11, 14, 19, 20), 従って私達の試金は抽出のステップなしでグラム汚されたスライドから直接回復されるDNAを使用し、普遍的なプライマーを利用し、簡単な議定書の細菌の広い範囲の同一証明を可能にする。 示されているように、これは、ＰＣＲサイクルの数が限られているので、細菌ＤＮＡの競合的増幅を可能にするので、正常な背景常在細菌叢の存在下でさえ達成 提出された標本の品質および形態学的に異なる微生物の相対的な割合は、グラム染色で容易に決定することができるので、適切な塗抹標本は、DNA増幅 さらに、優勢な生物のグラム染色外観は、遺伝子型同定後の内部品質管理として役立つ。 表現型同定と同様に、いずれの方法も植民地化と感染を確実に区別することができないため、治療決定が行われる前に、私たちのアッセイの結果は臨床像と相関しなければならない。

ガラススライド（3、8）上の臨床標本からの核酸の回収を記述する英語文献のいくつかの報告の中で、これまでのところ、グラム染色スライドからの細菌の回収後のDNA増幅を記述していない。 この方法は高速で信頼性が高く，臨床グラム染色スライド上に生物が豊富に見られるが，培養中に回収できない場合のツールとして使用できる。 この技術は、診断が遡及的に求められる場合、または元のサンプルが廃棄された後に特に有用であり得る。

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