好気性生物学の出現は、原始的なシアノバクテリアが水を光酸化する能力を進化させた約二十億年前に予告された。 酸素は廃棄物として放出され、大気中のO2レベルは急速に上昇した。 酸素雰囲気へのこの急速な変化は壊滅的な汚染物質を導入しましたが、最終的には生物が進化し、O2削減のための強力な駆動力を活用しました。 酸素を結合して活性化することができる酵素活性部位が進化し、O2を熱力学的シンクとして使用して、そうでなければ好ましくない反応を駆動す 食物代謝の効率は劇的に変化した。 例えば、グルコースを好気的に代謝することによって産生され得るATPの量は、ほぼ20倍に増加した。 真核生物は酸素雰囲気の直後に現れ、最終的には今日存在する多細胞生物の多様な配列が続いた。 私たちの好気性生化学では、O2は、細胞の成長、発達、および再生のほぼすべての側面にとって基本的な合成反応の茄多に使用されています。しかし、その生化学的多様性にもかかわらず、>私たちが消費する酸素の95％が呼吸に使用されています。 食物から誘導された高エネルギー電子は、一連のexergonic酸化還元反応においてミトコンドリアの電子輸送鎖を横断する。 これらのエネルギー的に下り坂の電子移動は、最終的にATPを生成する化学浸透性プロトン勾配を開発するために使用されます。 酸素はこの呼吸カスケードの最終的な電子受容体であり、水への還元は、低エネルギーの使用済み電子のミトコンドリア鎖を除去するための媒体として使用される。 このプロセスを触媒する酵素であるシトクロムオキシダーゼは、ミトコンドリア膜にまたがっている。 それは結合し、活動化させ、そして毎秒250までのO2の分子を減らし、chemiosmotic勾配に貢献するプロトンの転座にこのプロセスで解放されるエネルギーを結合します。 シトクロムオキシダーゼがこの驚くべき化学を触媒する機構を激しく研究してきた。 Fabian、Wong、Gennis、およびPalmerによってこの問題で報告された結果は、このプロセスに関する新しい洞察を提供し、酸素を利用する酵素がO2を活性化してO2結合の切断と還元を行う方法について統一的な概念が存在するという成長する概念を支持する(1)。
シトクロムオキシダーゼにおけるO2の還元は、厳しい制約の下で起こる。 このプロセスは、活性部位からの部分的に還元された有毒な酸素中間体の放出が最小限に抑えられ、o2還元で利用可能な自由エネルギーは、プロトン転座（2、3）に高効率で結合されている、少し過剰電位で行われます。 この酵素は、ヘムa3と呼ばれるヘムFeと、O2が結合して還元される二核中心にあるCuBと呼ばれる銅イオンを用いて、これらの制約の下で動作する（図 図1.1.1.1).1). このサイトへの電子入力は、第二のヘム鉄、ヘムa、および第二の銅中心、CuAを介してシトクロムcから発生します。 最近では、吉川のグループ(4)とミシェルのグループ(5)が独立して同時に酵素の結晶構造を提供し、特にプロトンと酸素がタンパク質をどのように移動するかという触媒サイクルの多くの側面に深い洞察を与えている。 オキシダーゼによるO2還元のメカニズムは、様々な分光技術を用いて多くのグループによって追求されている（レビューについては、refs. 6および7）。 この研究から、二核中心における一時的ではあるが検出可能な中間体を含む単純化された反応シーケンスは、以下のように記述することができる（図 図1.1.1.2):2):
pおよびF種は、特に、プロトン転座を駆動するポンピング機構に関与しているため、注目を集めている(8)。 Michel(9)とWikströmと同僚(10)からの最近の研究は、膜を横切るendergonicプロトン運動と酸素へのexergonic電子移動を結合するメカニズムの我々の理解の進歩と不確実性の両方を強調している。
シトクロムオキシダーゼの二核中心。 ヘムa3およびCuBは、ヘム鉄の近位配位子H376およびY244に架橋されているCuB配位子H240と共に示されている(24,25)。 O2結合および還元は、a3鉄とカブの間の領域で起こる。
シトクロムオキシダーゼとO2との反応のための単純化されたスキーム。 ヘムa3、カブ、および架橋されたH240-Y244（H-Y）構造を含む二核部位が示されている。 中心の酸化された形態の還元およびプロトン化は、還元された部位を生成する。 これはO2に結合して最初にオキシ種を形成し、これはさらに反応してPおよびF中間体を生成し、酸化された形態の酵素を再生する。 ＰおよびＦの還元は、示されるように、プロトン移動反応によって制限される。 Ｐとサイトの還元型との間のステップは赤い矢印で示されるプロトンポンプ過程に関与している。 これらのステップの化学量論は現在の調査の問題であるが、完全なサイクルの間に最大4つの陽子をポンピングすることができる。
シトクロムオキシダーゼの二核中心における酸素化学とプロトンポンプへのリンケージを解明する上での継続的な問題は、上記のスキームで中間体の分子構造を確立することである。 F中間体はヘムa3、a34+≤Oでフェリル-オキソ中間体を含むことがコンセンサスがあります(3, 6, 11, 12), しかし、Pの構造はかなりの論争の問題となっています。 この種の最初の割り当ては、それが無傷の結合、a33+—O2β種を含んでいると仮定し、したがって”ペルオキシ”のためのPとしての指定（例えば、refs。 および１ ３）。 しかし、WengとBakerは、彼らの光学データを解釈して、O2O結合切断がすでにPで発生しており、この種も二核中心にa34+π O構造を持っていたことを示した（14）。 この結論は、その後、いくつかの分光学的調査（15-17）によって支持された。 Kitagawa、Proshlyakovらは、ラマン分光法を用いて、酸化酵素に過酸化物を添加することによって生成されたPの形でa34+γ O延伸運動（18、19）を検出することに成功した。 その後の研究は、酸素が酵素の二電子還元型に添加されたときに同じ振動が観察され、オキシダーゼにおける酸素化学および過酸化物化学が共通の中間体を介して進行することを確認することを示した（20）。 さらに、この研究におけるPの出現の時間経過は、この種が運動学的に有能であることを示した（参考文献も参照。 および２ ２）。 したがって、分光学的研究から、および最近の計算的研究からも（23）、新たな見解は、Pが実際にO≤O結合切断種であるということである。Fabianらによって報告された研究。
(1)O≤O結合がpレベルでシトクロムオキシダーゼで切断されていることを新規、独立した、と説得力のある証拠を提供します。 彼らの実験では、結合無傷のペルオキシ構造中の酸素原子は溶媒水と交換しない可能性が高いと推論した。 しかし、Pがa34+∞O種として発生する場合、第2の酸素原子はおそらく水酸化物または水のレベルにあり、この酸素は水性緩衝液中の水とよく交換 H216Oを含む水性緩衝液中の基質として18O2を使用して、彼らはP中間体を捕捉し、H218Oの外観のためにアッセイした。 彼らの質量分析の結果は、18O2基板からの単一の酸素原子が溶媒水と交換可能であることを明確に示しており、上記の分析および結合切断されたフェリルオキソ種としてのPの割り当てと優れた一致を示している。Pがa34+≤O構造を持つという実現には、多くの重要な意味があります。
Pがa34+≤O構造を持つという実現には、多くの重要な意味があります。 オキシ種中の結合したO2の水酸化物（または水）およびp中のフェリル-オキソへの変換は、合計四つの電子を必要とする。 しかし、二核中心では、ヘムa3から+2価状態から+4価状態になり、カブから第一銅から第二銅に酸化されるため、三つだけが容易に利用可能である。 第四の電子の源は不明である。 いくつかのペルオキシダーゼの化合物Iで起こるように、ヘム大環状の酸化は、ラマンおよび光学データ（6、7）に基づいて除去することができ、Cu3+は生物学的環境では検出されていない。 最も可能性の高い候補は、その後、トリプトファンが酸化還元活性であるシトクロムcペルオキシダーゼ、または酸化可能なチロシン残基を含むプロスタグランジン合成酵素（24）で起こるように、酸化還元活性タンパク質側鎖である。 吉川ら(25)は、酸化還元活性側鎖の発生を強く支持する顕著な結晶学的証拠を提供した。 彼らは、二核中心のY244がCuB配位子の一つであるH240に架橋され、フェノールヘッド基が-OH基がO2結合空洞に直接指すように配向していることを示した（Fig. （図1）。1).1). Michelは同様の結晶学的データを報告しており（26）、Buseと共同研究者は最近、H240-Y244架橋の発生を支持する生化学的データを報告している（27）。 関与する特定の側鎖（複数可）は同定されていないが、最近のEPRデータは、過酸化物が休止酵素に添加されたときにチロシルラジカルの存在を示すことも報告されている（28、29）。 まとめると、これらの結果は、架橋チロシンがシトクロムオキシダーゼによるO2の活性化と還元における第四電子の源であることを強く示唆している。 この予想は、図１の反応サイクルの単純化を導く。 図1.1.1.2,2は、架橋されたH-Y構造が明示的に示され、P中間体の中性チロシルラジカルに酸化されることが提案されている。
図中のスキーム。 図1.1.1.22は、酸素–酸素結合開裂化学および反応から生じる生成物の観点から、シトクロムオキシダーゼとペルオキシダーゼおよびカタラーゼとの類推を強調している。 オキシダーゼでは、この酵素は活性部位の金属から三つの電子を抽出し、有機部分から四つの電子を抽出して、一段階でO2をO2およびOH—に還元する。 これらの生成物の両方は水のレベルにあるが、さらなるプロトン化および放出は反応の後のステップでのみ起こる。 ペルオキシダーゼおよびカタラーゼでは、この酵素は活性部位の金属から一電子を抽出し、有機部分から二電子を抽出して、一段階でH2O2をO2およびOH—に還元する。 ペルオキシダーゼおよびカタラーゼでは、この化学の直接の生成物は、フェリル-オキソ種と有機ラジカルを含む化合物Iである。 これらの構造は、シトクロムオキシダーゼのPに生じるa34+γ O/ラジカル構造に正確に類似している。 化合物I中の有機ラジカルは、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼ酵素の後続の工程で還元され、フェリルオキソ構造を維持する化合物IIを生成する。 オキシダーゼでは、同じ化学がF中間体を生成するために起こる。 酸素代謝ヘムタンパク質の化学的類似性は、Pのa34+γ O構造の実現とともに浮上しており、他の酸素代謝酵素が酸素および過酸化物の活性化および還元において同じ種類の化学に従う可能性があることを示唆している。
興味深い戦略が図から出てくる。 図1.1.1.オキシダーゼが酸素化学をプロトンポンプにどのように結合するかという点で22。 ポンピングステップは、pが形成された後（8-10）にのみ発生し、これは酵素が最初に活性化し、O2を完全に還元されたが不完全にプロトン化された生成物の水分子に還元することを意味する。; この酵素は、酸素への電子の四電子移動を完了し、ポンプに係合する前に、高度に酸化a34+γ Oおよびラジカル種として生じる自由エネルギーを貯蔵する。 結合開裂化学に関する最近の計算は、ラジカルとフェリル-オキソの形成によるo2のオキソおよびヒドロキシオキソへの還元がthermoneutral（23）に近いことを示しているので、このアイデアを支持している。 これは、反応サイクルでは発生しないため、毒性のある部分的に減少した酸素種を回避するための非常に効果的な戦略を表しています。 さらに、サブステート酸素生成物からタンパク質にポンプを駆動するために使用される自由エネルギーを転送することにより、オキシダーゼは、プロトン転