Effect van cholesterol op de structuur van een fosfolipide bilaag

trefwoorden:

• biomembraan
• moleculaire simulatie
• fasegedrag
• dimyristoylfosfatidylcholine
• mesoscopisch model

In dit artikel wordt een schijnbaar eenvoudige thermodynamische vraag gesteld: Hoe verandert het oppervlak per molecuul van een fosfolipide membraan als we cholesterol toevoegen? Deze vraag werd voor het eerst gesteld door Leathes (1) in 1925 en wordt vandaag nog steeds besproken. De Betekenis van deze vraag heeft direct betrekking op het belang van cholesterol voor het functioneren van membranen van hogere eukaryoten. Cholesterol regelt bijvoorbeeld de vloeibaarheid van het membraan en moduleert de functie van membraaneiwitten (2). Het begrijpen van deze mechanismen heeft vele onderzoekers gemotiveerd om de lipide–cholesterol interactie in detail te onderzoeken. Omdat een membraan kan worden gezien als een 2D vloeistof, een eerste schatting van hoe het gebied per molecuul zou veranderen bij de toevoeging van cholesterol zou zijn om te veronderstellen ideale mengen, waarbij het gebied per molecuul is gewoon een gewogen gemiddelde van de zuivere-componenten gebieden. In 1925 toonde Leathes aan dat men, in plaats van ideale menging, een opvallend nonideaal gedrag waarneemt (1). Dit nonideaal gedrag wordt het condenserende effect (3) genoemd omdat het gebied per molecuul veel lager is in vergelijking met het ideale mengen. Omdat een membraan zich gedraagt als een incompressible vloeistof, zal een afname van het oppervlak per molecuul resulteren in een overeenkomstige significante toename van de totale dikte van de dubbellaag. Een dergelijke toename van de dikte signaleert een reorganisatie van de structuur van het membraan. Omdat veranderingen in de structuur van het membraan belangrijke gevolgen kunnen hebben voor het functioneren van eiwitten (2), is het belangrijk om een beter moleculair begrip te hebben van de cholesterol-geïnduceerde veranderingen.

verschillende conceptuele modellen zijn voorgesteld om de niet–ideale cholesterol-lipideninteracties te verklaren. Voorbeelden zijn het gecondenseerde complexenmodel (4, 5), het superlattice-model (6) en het Paraplu-model (7). Het gecondenseerde complexenmodel verklaart het condensatie-effect door aan te nemen dat cholesterol de reversibele vorming van een stoichiometrisch cholesterol–lipidencomplex induceert. In zo ‘ n complex wordt het membraan gecondenseerd omdat de lipide acylketens meer geordend zijn. Bij een gegeven cholesterolconcentratie bestaat er een evenwichtssamenstelling tussen deze gecondenseerde cholesterol–lipidencomplexen en gewone lipiden. Het superlattice model gaat ervan uit dat bij kritische concentraties de cholesterolmoleculen een specifieke orde van lange afstand vertonen. Het overkoepelende model gaat ervan uit dat het hydrofiele deel van cholesterol te klein is en dat de lipiden daarom moeten bijdragen aan de screening van de cholesterolmoleculen van hydrofobe interacties met water. De fosfolipiden kunnen deze paraplu alleen creëren als deze moleculen rechttrekken om ruimte te maken voor cholesterol. In deze modellen zijn de onderliggende mechanismen die leiden tot condensatie zeer verschillend. Interessant is dat een recente experimentele studie concludeerde dat hun gegevens het gecondenseerde complexenmodel ondersteunden (8), terwijl een andere reeks experimenten geen indicatie van de gecondenseerde complexen vond en het overkoepelende model ondersteunde (9). Deze verschillen in inzichten motiveerden ons om een mesoscopisch model te ontwikkelen van een lipide–cholesterol–watersysteem. We gebruikten moleculaire simulaties om wat licht te werpen op de laterale organisatie van cholesterol in lipidenmembranen en de onderliggende lipide–cholesterol interacties die het condensatie-effect induceren.

verschillende moleculaire simulaties van alle-atomen en grofkorrelige modellen van cholesterol in lipide bilagen zijn gerapporteerd in de literatuur (voor enkele recente voorbeelden, zie refs. 10-13 en verwijzingen daarin). Idealiter zou men gebruik willen maken van alle-atoom simulaties om het condenserende effect te bestuderen over een groot scala aan temperaturen en samenstellingen. Op dit moment zijn deze simulaties echter te tijdrovend. Daarom gebruiken we een grofkorrelig model, waarbij efficiëntie wordt verkregen door enkele details van een all-atom model te integreren. Ons model is gebaseerd op het model van Kranenburg en collega ‘ s (14, 15). Het model maakt gebruik van expliciete watermoleculen. Lipiden en cholesterol bestaan uit hydrofiele en hydrofobe deeltjes (zie Fig. 1). Dit model knoopt groepen atomen in één mesoscopisch pseudoatoom. De intramoleculaire interacties omvatten bindtrillingen en bindbuiging waarvan de parameters zijn geoptimaliseerd om de structuur van een enkel atoom fosfatidylcholinemolecuul in water na te bootsen. De hydrofiele en hydrofobe interacties worden beschreven met soft-repulsive interacties, en de parameters van deze interacties zijn gerelateerd aan de oplosbaarheidsparameters met behulp van de methode beschreven door Groot en Rabone (16). Het idee van dit model is dat de belangrijkste drijvende krachten van cholesterol–fosfolipiden mengen zijn de hydrofobe en de hydrofiele interacties, dat is de conclusie van vele experimentele studies (7, 9, 17). In ons model is de eenheid van lengte direct gerelateerd aan de effectieve grootte van een pseudoatoom, dat wil zeggen dat een pseudoatoom een volume van 90 Å3 inneemt. De eenheid van energie volgt uit de aanpassing van de zachte afstotingsparameters van de mesoscopische waterdeeltjes aan de samendrukbaarheid van water onder omgevingsomstandigheden. De eenvoud van de modellen vereist een reparameterisatie van deze zachte afstotingen als de temperatuur wordt gewijzigd. In dit werk gaan we er echter van uit dat de parameters onafhankelijk zijn van de temperatuur. De temperatuurschaal wordt ingesteld door aan te passen aan de overgangstemperaturen van de experimentele fase. Verdere details en toepassingen van dit model zijn te vinden in ref. 18.

Ons model van cholesterol, weergegeven in Fig. 1B, is gebaseerd op dezelfde veronderstellingen over de effectieve grootte en interacties als het lipidenmodel. Na McMullen et al. (19) hebben we het hydrofobe deel van het cholesterolmodel iets langer gemaakt dan het hydrofobe deel van het lipidenmodel, dat dimyristoylfosfatidylcholine (DMPC) wil vertegenwoordigen. Voor de eenvoud hebben we aangenomen dat de hydrofobe en hydrofiele interacties van een cholesterolmolecuul vergelijkbaar zijn met die in een lipide. Om inzicht te krijgen in het moleculaire mechanisme van het condenserende effect van cholesterol, hebben we drie cholesterol-achtige moleculen geïntroduceerd waarin we de hydrofobe–hydrofiele balans van het molecuul verstoren: één waarin we de hydrofobe staartlengte verlagen (zie Fig. 1C), een waarin we een extra hydrofobe groep toevoegen (Fig. 1D), en een waarin we de ring vervangen door een eenvoudige ketting (Fig. 1E).

Fig. 2 toont het berekende temperatuursamenstellingsfasediagram van het water–fosfolipide–cholesterolsysteem. De fasegrenzen werden verkregen door een visuele inspectie van de snapshots en, meer kwantitatief, van de buigpunten van de krommen die het oppervlak per lipide, de gemiddelde hydrofobe dikte van het membraan, en de staartvolgorde en kantelparameters geven. Deze eigenschappen werden berekend als functie van temperatuur en cholesterolgehalte.

laten we ons eerst concentreren op de zuiver-lipidefasen, en het effect van cholesterol zal hierna worden besproken. Voor de zuiver-lipide bilayer is het fasediagram berekend door Kranenburg en Smit (14) voor een systeem dat vier keer kleiner is. We gebruikten dezelfde methodologie om de fasegrenzen te bepalen als Kranenburg en Smit deden (14). Onze resultaten zijn in uitstekende overeenstemming met deze studie, die aangeeft dat de eindige-grootte effecten klein zijn. Voor de zuivere fosfolipide zien we bij hoge temperaturen een vloeibare fase (La) waarin de staarten verstoord zijn. Bij lage temperaturen worden de staarten geordend en gekanteld, wat de gelfase (L ‘ C) definieert. Deze twee fasen worden gescheiden door de gerimpelde fase (P’β), waarin we een microfasescheiding waarnemen van domeinen waarin de bilaag dik is en de lipiden geordend zijn en domeinen waarin de bilaag dun is en de lipiden ongeordend. De aanwezigheid van deze drie fasen geeft aan dat het resulterende fasediagram zeer goed overeenkomt met het experimentele diagram van het zuivere lipide (20). De temperatuurschaal wordt ingesteld door de temperaturen van de faseovergangen van de gelfase naar de rimpelfase (TP) en de rimpelfase naar de vloeibare fase (Tm) te matchen met de overeenkomstige experimentele faseovergangstemperaturen van pure DMPC. Een verdere vergelijking met de experimentele gegevens wordt gemaakt voor het gemiddelde oppervlak per molecuul van de bilaag (Fig. 3A), voor de bilaagdikte (Fig. 4A), en voor de lipide staartorde (Fig. 4B). Voor het gebied per lipide krijgen we 56 Å2 per molecuul vergeleken met de experimentele (21) 60 Å2 per molecuul. Voor de bilaagdikte berekenden we een waarde van 38,7 Å, die goed te vergelijken is met de experimentele waarde van 36 Å (21), en een soortgelijke overeenkomst wordt verkregen voor de staartvolgorde (zie Fig. 4B). Om de oppervlakte per molecuul te berekenen voor pure cholesterol, simuleerden we een dubbellaag van pure cholesterol. We hebben een waarde van 40,3 Å verkregen, die zeer goed te vergelijken is met de meest recente experimentele waarde van 41 Å (22) voor een monolaag van cholesterol. Gezien de benaderingen in ons model, is de overeenkomst tussen de experimentele en de gesimuleerde waarden verrassend goed.

laten we nu kijken naar het effect van cholesterol op de eigenschappen van de bilaag. De eerste vraag die we zullen beantwoorden is of ons model het condensatie-effect kan reproduceren. Fig. 3A toont het effect van cholesterol op het gebied per molecuul als functie van de cholesterolconcentratie. De vergelijking met de experimentele gegevens toont eens te meer een zeer goede overeenkomst. In deze figuur tonen we ook het oppervlak per molecuul uitgaande van ideale menging. Dit cijfer illustreert op overtuigende wijze het condensatie-effect; het oppervlak per molecuul neemt veel meer af dan men op basis van ideale menging zou verwachten. Andere experimentele gegevens omvatten het effect van cholesterol op de bilaagzwelling (Fig. 4A) en de staartvolgorde parameter (Fig. 4B). Zowel de experimentele gegevens als de simulatie tonen aan dat cholesterol de dikte van de bilaag en zijn orde verhoogt. Ook voor deze twee eigenschappen komen onze simulatieresultaten zeer goed overeen met de experimentele gegevens. De simulatie-en experimentele gegevens (Fig. 3A en 4 A en B) tonen aan dat de toevoeging van cholesterol de eigenschappen van de lipide bilayer sterk wijzigt tot ±30 mol% cholesterol. Hierna wordt een gebied bereikt waar verdere toevoeging van cholesterol slechts een gering effect heeft. Bij 30 mol% cholesterol, hebben zowel het gebied per molecuul als de lipide staartorde en kantelparameters waarden die typisch zijn voor de gelfase.

de kleurcodering in Fig. 2 geeft het verschil weer tussen het gesimuleerde oppervlak per lipide en de geschatte waarde, uitgaande van een optimale menging. We zien dat bij hoge en lage temperaturen het condensatie-effect relatief klein is. Het condensatie-effect is maximaal in een welomschreven gebied in faseruimte dat zich net boven de hoofdfaseovergang van de zuivere fosfolipide bevindt. Om de aard van het condensatie-effect beter te begrijpen, is het belangrijk om het effect van het toevoegen van cholesterol op het fasegedrag van het membraan te begrijpen.

Fig. 2 toont de belangrijkste kenmerken van het fasediagram. De verschillende fasen die we geobserveerd hebben in onze simulaties zijn ook experimenteel geobserveerd, hoewel niet altijd voor het specifieke mengsel van DMPC en cholesterol (20, 23, 24). De verschillende experimentele studies tonen echter kwalitatief zeer verschillende fasediagrammen, wat onze mogelijkheden om een gedetailleerde vergelijking te maken beperkt. Snapshots van de verschillende fasen zijn te vinden in Fig. 5.

bij zeer hoge temperaturen heeft de toevoeging van maximaal 50 mol% cholesterol weinig effect op de structuur van het membraan, en we observeren de la-fase voor alle concentraties (24). Bij temperaturen onder Tp, merken we op dat cholesterol de structuur van de gelfase verandert door het remmen van de kanteling van de lipide staarten, waardoor de vorming van de l ‘ c fase (20) (vergelijk Fig. 5 D met E). Bij hogere cholesterolconcentraties (>20%) zien we de vorming van kleine, cholesterolrijke clusters. We wijzen deze fase aan met LII, en deze fase wordt weergegeven in Fig. 5E. bij temperaturen tussen Tp en Tm, is de zuivere bilaag in de rimpelfase, en cholesterol transformeert deze rimpelfase (zie Fig. 5C) in een vloeistofgeordende fase (23) (Fig. 5B). De term vloeistof-geordende fase werd geïntroduceerd door Ipsen et al. (25). De dikte van de dubbellaag is tussen de dikte van de vloeistof en de gelfase. De lipide staart-orde parameters hebben waarden die dicht bij de gelfase zijn; nochtans, in tegenstelling tot de gelfase, zijn de lipiden meer wanordelijk en kantelen niet. Cholesterol verhoogt geleidelijk de temperatuur waarbij de la naar Lo faseovergang plaatsvindt. Bij zeer hoge cholesterolconcentraties verandert de vloeistof-geordende fase in een gelfase (LII) wanneer de temperatuur onder Tm wordt verlaagd. Deze fase is experimenteel waargenomen voor dipalmitoylfosfatidylcholine (26), maar we hebben geen experimentele gegevens gevonden voor DMPC onder deze omstandigheden. Laten we nu terugkeren naar het condensatie-effect. Fig. 2 laat zien dat het condensatie-effect maximaal is bij een temperatuur net boven de hoofdovergang Tm. De reden is dat bij deze omstandigheden de zuivere bilaag in een vloeistof-wanordelijke toestand is, terwijl de toevoeging van cholesterol aan de bilayer het in een vloeistof-geordende fase omzet, die een oppervlakte per lipide heeft die veel kleiner is in vergelijking met de vloeistof-wanordelijke toestand. Dit grote verschil veroorzaakt een groot condensatie-effect. Bij hogere temperaturen blijft de vloeibare fase stabiel voor alle cholesterolconcentraties, wat een veel kleiner condensatie-effect geeft. Bij lagere temperaturen heeft de zuivere lipide bilayer een oppervlakte per lipide die veel dichter bij het gebied per lipide van de vloeistof-geordende fase ligt, en als gevolg daarvan is het condensatie-effect veel minder.

bovenstaande resultaten geven aan dat het condensatie-effect een direct gevolg is van bepaalde veranderingen in het fasegedrag dat cholesterol induceert. In de literatuur zijn er verschillende speculaties over die aspecten van de cholesterolstructuur die specifiek verantwoordelijk zijn voor het condenserende effect ervan. Het paraplumodel is bijvoorbeeld gebaseerd op het idee dat vergeleken met fosfolipiden, het hydrofiele deel van cholesterol veel kleiner is en de fosfolipide als paraplu nodig heeft voor extra screening van interacties met water. Dit suggereert dat een extra hydrofiele groep de eigenschappen volledig zou veranderen. Een andere belangrijke factor is de omvangrijke ringstructuur; als we de ring vervangen door een staart krijgen we een molecuul dat meer op een alcoholmolecuul lijkt (27). Het verkorten van de hydrofobe staart zou echter weinig effect hebben. Fig. 1 toont de gemodificeerde cholesterolmoleculen die deze veranderingen nabootsen. Inderdaad, de resultaten in Fig. 3B laat zien dat het verkorten van de staart van cholesterol hetzelfde condensatie-effect vertoont. Echter, Fig. 3B toont aan dat Voor beide andere modificaties van het cholesterolmolecuul, het toevoegen van een extra hydrofiele groep en het vervangen van de ring door een lineaire keten, geen condenserend effect wordt waargenomen. We observeren het tegenovergestelde effect: het toevoegen van deze molecules veroorzaakt de dubbellaag om meer uitgebreid te worden vergeleken met het ideale mengen. Het effect van (kleinere) alcoholen op het oppervlak per molecuul is experimenteel gemeten, en de experimentele gegevens laten ook een toename zien (28). Nauw hiermee verbonden merkten we op dat Voor beide gevallen in het fasediagram de vloeibare fase stabiel was over het gehele concentratiebereik. In feite merken we op dat het toevoegen van deze moleculen de belangrijkste overgangstemperatuur verlaagt, en dus is er geen gebied in het fasediagram waar er een groot condensatie-effect is.

simulaties met deze structurele variaties van cholesterol geven aan hoe verrassend subtiel het mechanisme is. De belangrijkste overgang in een zuivere dubbellaag is zeer gevoelig voor de hydrofobe interacties. De hoofdgroepen van de lipiden screenen de hydrofobe staarten uit het water. Bij hoge temperaturen, is het gebied per lipide hoog, en deze screening is verre van optimaal; maar bij deze voorwaarden domineert de keten entropie. Het verlagen van de temperatuur maakt het steeds belangrijker om de hydrofobe interacties te screenen en bij de hoofdovergang veroorzaakt uiteindelijk een ordening van de ketens. Een belangrijk aspect is om te begrijpen hoe cholesterol de vloeibare fase destabiliseert. Cholesterol heeft een kleinere hydrofiele kop en is daarom minder efficiënt in het afschermen van de hydrofobe interacties. Bij hoge temperaturen, kan de lipide bilayer dit aanpassen, maar bij lagere temperaturen kunnen de lipiden slechts bijdragen aan het onderzoek van de cholesterol door zijn gebied per lipide te verminderen. Dit veroorzaakt de waargenomen volgorde en verklaart waarom de belangrijkste overgang toeneemt. De twee veranderingen die we introduceerden in de cholesterolstructuur beïnvloeden de hydrofobe screening.; in beide varianten verdwijnt de intrinsieke onderafscherming van cholesterol. Als deze molecules aan de dubbellaag worden toegevoegd, is er geen behoefte aan extra onderzoek van de hydrophobic interactie, en deze molecules verhinderen de vorming van een geordende fase.

laten we onze waarnemingen vergelijken met de vorige modellen die zijn geïntroduceerd om het condensatie-effect te verklaren. Ten eerste geeft ons model geen enkele indicatie van de lange-afstands volgorde zoals wordt aangenomen in het superlattice model. Impliciet in zowel het overkoepelende model als de gecondenseerde complexen is de veronderstelling van een soort lokale organisatie. Bijvoorbeeld, in het paraplumodel wordt aangenomen dat één lipidemolecuul één of twee naburige cholesterolmoleculen zou kunnen screenen (Zie bijv., ref. 2). Onze simulaties tonen een veel meer wanordelijke structuur waarin we deze geordende structuren niet kunnen identificeren. Op dit punt is het belangrijk om in herinnering te brengen dat ons model veel veronderstellingen bevat, en dit roept de vraag op of de conclusies die we uit onze simulaties trekken relevant zijn voor de experimentele systemen. We waren zeer verrast om te zien dat we in staat waren om zo ‘ n rijk fasegedrag te verkrijgen door gebruik te maken van een grofkorrelig model dat puur afstotende krachten gebruikt. Ons model geeft een zeer redelijke kwantitatieve beschrijving van recente experimentele gegevens over de structuur van de dubbellaag. Het andere interessante aspect is dat onze berekeningen voorspellen dat het condensatie-effect maximaal is in een smal temperatuurbereik boven de hoofdovergang. Het zou mogelijk zijn om dit experimenteel te verifiëren. Een zeer strenge test van ons model zou een gedetailleerde vergelijking met de experimentele fase diagram zijn geweest. In dit verband is het bemoedigend dat de fasen die we hebben gevonden experimenteel zijn waargenomen, hoewel niet altijd voor precies het gesimuleerde systeem. Door zorgvuldig die experimentele gegevens te selecteren die overeenkomen met onze simulaties zouden we zelfs een zeer goede overeenkomst kunnen claimen. Een mogelijke reden voor de onenigheid tussen de verschillende experimenten is dat verschillende technieken worden gebruikt, en niet alle technieken zijn even gevoelig voor de verschillen in de structuur van de verschillende fasen. Wij hopen dat de combinatie van een fasediagram en gedetailleerde informatie over de structuur van de verschillende fasen enige richtlijnen geeft over de vraag of een bepaalde experimentele techniek een bepaalde faseovergang kan identificeren.