alle methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Informed consent werd verkregen van alle proefpersonen.
materiaal
De volgende Zilveren verbanden werden vergeleken: Acticoat (Smith&Nephew, UK; in dit artikel aangeduid als Ac), Aquacel Ag + Extra (Convatec, UK; in dit artikel aangeduid als Aq), Silvercel Hydro-alginaat( Systagenix, UK) ; in dit artikel aangeduid als Sc), en Ialugen Plus (Ibi, Tsjechië; in dit artikel aangeduid als Ia).
andere chemische stoffen werden verkregen uit Sigma–Aldrich (St.Louis, vs), tenzij anders vermeld.
bereiding van extracten
bij verschillende tests werden extracten van het verband gebruikt in plaats van het verband zelf. Deze extracten werden bereid met fysiologische zoutoplossing (0,9% (w / v) NaCl) of celcultuurmedia aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). De verhouding tussen het verbandoppervlak en de oplossing was 1 cm2 per 4 mL oplossing. Extractie werd uitgevoerd gedurende 72 uur bij RT met constant schudden. De extracten werden gesteriliseerd door ze door een filter van 0,2 µm te laten lopen en tot gebruik bij 4 °C bewaard.
Zilverconcentratie meting
De zilverconcentraties in het verband en de extracten van het verband werden gemeten met ICP-OES. De zilverconcentratie werd ook geëvalueerd in ex vivo huidmonsters van varkens. 10-70 mg van elk monster werd overgebracht naar een PTFE-vat voor microgolfvertering. Vervolgens 1 mL geconcentreerd salpeterzuur (sporenanalyse grade, Analytika Ltd., Tsjechië), 0.8 mL geconcentreerd zoutzuur (sporenanalyse grade, Analytika Ltd., Tsjechië) en 0,2 mL waterstofperoxide (p. a. 30%, Penta Ltd., Tsjechische Republiek) toegevoegd. Het monster werd gedurende 5 minuten bij 150 °C verteerd en vervolgens, in de tweede stap van dezelfde cyclus, gedurende 10 minuten bij 200 °C. Na de vertering werd het monster kwantitatief overgebracht met 0,2 mL waterstofperoxide en gedeïoniseerd water.
de analyse werd uitgevoerd met een ICP-OES-instrument (Radial 725, Agilent Technologies, Australië) uitgerust met een pneumatische vernevelaar en een cyclonische spuitkamer. De kwantificering was gebaseerd op externe kalibratie. De nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de methode werden getest met varkenshuid monsters verrijkt met bekende concentraties Ag uit een gecertificeerde referentieoplossing (Analytika Ltd., Tsjechië).
Scanning elektronenmicroscopie
Scanning elektronenmicroscopie (SEM) analyses werden uitgevoerd met behulp van een Zeiss Ultra Plus instrument (Zeiss, Duitsland). De steekproeven werden met een dunne laag Au/Pd in een Quorum SC7620 sputtercoater met een laag bedekt. De beelden werden genomen door twee secundaire InLens en se2 elektrondetectoren voor hogere of lagere vergroting, respectievelijk. Scanning parameters waren als volgt: acceleratiespanning, 3,5 kV; sonde stroom, 36 pA; en druk in de kamer, ~ 7 × 10-5 Pa.
EDX-beelden werden vastgelegd met het Zeiss Ultra Plus-instrument. X-ray kaarten en spectra werden genomen door een X-MaxN 80 X-ray detector (Oxford Instruments, UK). De EDX-parameters waren als volgt: acceleratiespanning, 10 kV; sondestroom, 300 pA; werkafstand, 8,5 mm; en procestijd, 4 .
directe oxidatieve activiteit van dressings
de vorming van ROS in celvrije omstandigheden werd geëvalueerd met behulp van 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) als substraat voor mierikswortelperoxidase (HRP). Cirkels met een diameter van 6 mm werden uit het verband gesneden en getest. In het kort bestond de werkoplossing uit 0,1 mg/mL TMB (stamoplossing c = 1 mg/mL in DMSO) 1:9 gemengd met 0,05 m citraat–fosfaatbuffer (pH = 5) en HRP (uiteindelijke c = 0,16 IE/mL). Elk stuk verband werd ondergedompeld in 0,5 mL van de werkoplossing en monsters (25 µL) werden verzameld bij 0, 5, 7,5 en 10 minuten. Onmiddellijk na de verzameling werden de monsters gemengd in de verhouding 1: 1 met 0,16 M H2SO4 en werd de absorptie afgelezen bij 450 nm (referentiegolflengte = 540 nm) met behulp van een NanoDrop OneC-instrument (ThermoFisher Scientific, US). 30% H2O2 werd gebruikt als positieve controle. Het achtergrondsignaal (blanco oplossing) werd afgetrokken.
Zilverpenetratie in de gedepitheliseerde huid
we hebben statische diffusie Franz-cellen gebruikt om de zilverpenetratie in de gedepitheliseerde huid te onderzoeken. De huid werd verkregen uit een lokaal Slachthuis (Bocus, Letohrad, Tsjechië) en verwijderd uit het binnenste deel van de porcine auricle. Haar werd geschoren, de huid werd geïncubeerd in PBS (60 ° C, 90 s), en de epidermis werd afgepeld. De gemiddelde dikte van de ont epithelized huid was 2 mm. de huidstukken werden in een kamer geplaatst en bedekt met een Getest zilver verband of een stuk gaas. Elke donorkamer werd gevuld met 0,3 mL nhdf-kweekmedium met 10% FBS. De acceptorkamer bevatte 0,7 mL kweekmedium. De diffusiecellen werden gedurende 24 of 48 uur bij 37 °C geïncubeerd. Na incubatie werd de huid gespoeld met PBS en werden de delen van de huid die de donor-en acceptorkamers scheidden, geanalyseerd op zilvergehalte met ICP-OES, zoals hierboven beschreven. De hoeveelheid zilver die door de ontgeepitheliseerde huid doordrong, werd gemeten in de donorvloeistof. Drie onafhankelijke replica ‘ s werden beide keren voorbereid.
kweek van ex vivo huid met verbanden
vers (1-2 uur) porcine auricles (Bocus) werden nauwgezet gereinigd met zeep en Betadine (een PVP-jodiumoplossing, Egis Pharma, Hongarije) en gespoeld met water. De huiddelen (1 × 1 cm) uit de oorschelpen werden verwijderd en in antibiotische oplossing (penicilline–streptomycine oplossing, 10.000 U/mL penicilline, 10 mg/mL streptomycine) gedurende 30 min bij 37 °C onder atmosferische O2 en CO2 geplaatst. Huidmonsters met intacte epidermis werden op de huidzijde naar boven geplaatst in 6-Wells kweekplaten met 3 mL NHDF-medium aangevuld met 10% FBS en vervolgens bedekt met 1 × 1 cm geselecteerd zilverhoudend verband of steriel controlegaas gedrenkt met 300 µl kweekmedium. De monsters werden gedurende 24 of 48 uur geïncubeerd. Daarna werd de huid gespoeld met PBS en elk van de huidexplantaten werd verdeeld in derden voor histologisch onderzoek (4% PFA fixatie bij 4 °C), eiwitanalyse door middel van Western blot (snap bevriezen met vloeibare stikstof), en qPCR (overnight in RNAlater (Thermo Fisher Scientific), dan bij − 80 °C).
histologische kleuring
De autometallografische kleuring van zilver werd goedgekeurd volgens Danscher et al.49. Beelden werden vastgelegd met behulp van een Eclipse 50i microscoop met een bijgevoegde DS-Fi1 camera (Nikon, Yokohama-Shi, Japan).voor de immunofluorescentie van yH2AX werden histologische secties op Superfrost Plus glaslides (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gedeparaffiniseerd en ‘ s nachts geïncubeerd met primair antilichaam (1:1.000, ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, clone JBW301, Millipore, MA, USA). Vervolgens werden ze gedurende 1 uur geïncubeerd met een secundair antilichaam (ab150114, Abcam, Cambridge, UK; verdunning 1:10 000) en gemonteerd op dia ‘ s met ProLong Diamond Antifade Mountant met DAPI (ThermoFisher Scientific). Beelden werden vastgelegd met een Nikon Eclipse ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japan) fluorescerende microscoop.
genexpressie
varkenshuid na incubatie met verbanden werd verwerkt voor RNA-isolatie, cDNA-synthese en qPCR-genexpressie zoals eerder beschreven door Klein et al.50 TaqMan Real-Time PCR analyses (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gebruikt voor qPCR waren: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. De drempelcycluswaarden werden genormaliseerd voor het rpl13a-huishoud-gen en werden gerelateerd aan gaasmonsters voor de specifieke tijd (interval van 24 of 48 uur) met behulp van de 2 – ΔΔCt-methode 51. Voor elke behandeling en tijd werden zes onafhankelijke monsters gemeten en gemiddeld. De Betekenis van verschillen in genexpressie ten opzichte van gaascontrole werd geëvalueerd gebruikend de T-test van de Student voor elk zilveren verband in de gespecificeerde tijd.
Western blotting
voor daaropvolgende Western blot analyse werden weefsellysaten bereid uit bevroren varkenshuid. Met een scalpel in een druppel lysisbuffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% natriumdeoxycholaat; 1% natriumdodecylsulfaat; 4% ureum), werd de huid in kleine stukjes gesneden, die vervolgens werden gehomogeniseerd in 350 µl van de lysis-buffer met behulp van een roestvrijstalen 5 mm kraal en een weefselhomogenisator (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Duitsland) gedurende 10 minuten bij 25 Hz. De eiwitconcentratie werd gemeten met behulp van BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific).
eiwitten in lysaten werden gescheiden met 4-15% gradiënt SDS-PAGE en overgebracht op polyvinylideendifluoride membranen. Om specifieke eiwitten te detecteren, werden membranen ‘ s nachts geïncubeerd in een blokkerende buffer (20 mM Tris; 137 mM NaCl; 0,05% Tween 20; 5% gedroogd vetarm melkpoeder) met het primaire antilichaam phospho-histone H2A.X (20E3) (1:1.000; Cell Signaling, US). β-actine werd gebruikt als een eiwithoeveelheid loading controle (1: 2000; Santa Cruz, US). De membranen werden ontwikkeld met HRP-geconjugeerde anti-konijn of anti-muis Ig met behulp van chemiluminescente detectie om signalen te visualiseren (Clarity Western ECL substraat; Bio-Rad, VS). De signalen werden gescand en geëvalueerd met een Alliance 9.7 Chroma Chemiluminescence Imaging System (UVITEC Limited, UK).
antibacteriële werking
De agardiffusiemethode werd gebruikt om de antimicrobiële werking van het verband te vergelijken. Een monsterstuk (1 cm2) van elk verband werd geïncubeerd op een vers geënte petrischaal met Staphylococcus aureus of Pseudomonas aeruginosa; deze stammen werden geïsoleerd uit chronische wonden bij de mens, gekarakteriseerd en gecultiveerd zoals eerder beschreven 52. Bovendien werd de antimicrobiële effectiviteit van verbandextracten (bereid in RPMI-medium met 10% FBS, zoals hierboven beschreven) vergeleken met behulp van de microdilutiemethode53. De optische dichtheid werd gemeten met een Ensight Multimode plaatlezer (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) bij 600 nm gedurende 24 uur (schudden, 37 °C).
celcultuur
normale humane huidfibroblasten van volwassen huid (nhdf) werden gekocht bij Lonza (Bazel, Zwitserland). NHDF werden gekweekt in Dulbecco ‘ s modified Eagles low glucose medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS, glutamine (0,3 mg/mL), glucose (4 mg/mL), penicilline (100 eenheden/mL) en streptomycine (0,1 mg/mL) in 75 cm2 cultuurkolven Onder 5% CO2 en bij 37 °C tot de vijfde passage. HaCaT keratinocyten werden gekocht bij Hölzel Diagnostika (Köln, Duitsland) en werden op dezelfde manier gekweekt, maar zonder toevoeging van glucose aan het medium.
Viability measurement
vijfduizend cellen per putje werden ‘ s nachts in een 96-wells plaat gezaaid met 200 µL kweekmedium met 10% FBS in een incubator (37 °C, 5% CO2). De volgende dag werden de cellen behandeld met 200 µL van een verdunningsreeks extracten van de verbanden (100%, 50%, 20%, of 10% van het oorspronkelijke extract verdund met kweekmedium aangevuld met 10% FBS) gedurende 24, 48 en 72 uur. Controlecellen werden behandeld met een standaard 10% FBS kweekmedium. De levensvatbaarheid werd gemeten zoals eerder beschreven 54 met behulp van de 3-(4, 5-dimethylthiazool-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromide (MTT) – test. MTT-stamoplossing (20 µL; c = 5 mg / mL) werd in elk putje aan het celkweekmedium toegevoegd. Vervolgens werd de MTT-oplossing verwijderd, 220 µL lysis-oplossing (1:1 propaan-2-ol met DMSO, 10% (M/v) Triton X-100 en 0,37% (m/v) HCl) toegevoegd en werd lysis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur uitgevoerd op een roterende shaker (150 tpm). De absorptie werd afgelezen bij 570 en 690 nm met een EnSight Multimode Plaatlezer (PerkinElmer, USA). De gegevens werden verwerkt in Kaleido (PerkinElmer, VS). De uiteindelijke absorptie werd berekend als A = A570-A690. De verandering in levensvatbaarheid van behandelde cellen ten opzichte van controlecellen werd berekend als verandering = (een monster/een controle – 1) × 100.
direct contact inhibition assay
cellen werden gezaaid met een dichtheid van 300 000 cellen per putje in een 6-putje plaat en geïncubeerd in het kweekmedium aangevuld met 10% FBS bij 37 °C en minder dan 5% CO2 totdat samenvloeiing werd bereikt. Verbanden werden in vierkanten van 1 cm2 gesneden, op de cellaag geplaatst en gedurende 6 uur geïncubeerd met het standaardkweekmedium. controlecellen werden alleen met het medium behandeld. Daarna werden de cellen gewassen met PBS en gedurende 15 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde. De cellen werden gekleurd met 0,1% (w/v) kristalviolet oplossing (opgelost in 10% ethanol) gedurende een uur en vervolgens gespoeld met water. De inhibitiezones werden gefotografeerd met een Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f digitale camera (Canon).
Fluorescerende kleuring van cellen
voor DNA-schadeanalyse werden NHDF-cellen op microscopische glaasjes in een 6-Wells-plaat gezaaid met een dichtheid van 2 × 105 per putje en ‘ s nachts toegelaten om te hechten. De volgende dag werden de cellen behandeld met 5 x verdunde verbandextracten en gedurende 24 uur geïncubeerd. vervolgens werden de cellen gefixeerd met 4% PFA gedurende 15 minuten. Na permeabilisatie en blokkering werden de objectglaasjes geïncubeerd met een primair anti-yH2AX konijnantilichaam (Celsignalisatie, US; 1:500 verdunning in een blokkerende buffer—20% FBS, 0,3 M glycine, 0,05% Tween 20 in PBS; overnight; 4 °C). De detectie werd uitgevoerd met een secundair antilichaam gelabeld met Alexa Fluor 555 (Abcam, UK; 1:500 in een blokkeerbuffer; 1 uur, RT). De dia ‘ s werden gemonteerd met behulp van ProLong Diamond Antifade Mountant met DAPI (ThermoFisher Scientific). Nadat de dia ‘ s waren gedroogd, werden beelden genomen met behulp van een Eclipse ti fluorescente microscoop (Nikon, Yokohama-Shi, Japan).
intracellulaire oxidatieve stress werd gedetecteerd met behulp van een DCF-DA-sonde, die gevoelig is voor de totale ROS-concentratie in cellen. De cellen werden ‘ s nachts in een 24-Wells plaat gezaaid en vervolgens gedurende 15 minuten geëtiketteerd met DCF-DA (1 µg/mL), waarna ze werden behandeld met 5 × verdunde verbandextracten en geïncubeerd bij 37 °C en minder dan 5% CO2. 5 mM H2O2 werd gebruikt als positieve controle. De groene fluorescentie van DCF werd elke 15 minuten gedurende een incubatieperiode van 90 minuten geregistreerd met behulp van een Incucyte S3 geautomatiseerde microscoop (Essen Bioscience, USA). De kwantificering van intracellulaire fluorescentie werd uitgevoerd in Fiji-software volgens de methode beschreven door Čepa55.
bepaling van oxidatieve burst door neutrofielen in volbloed
een onafhankelijke ethische commissie heeft de bloedmonster verzameling voor neutrofielen oxidatieve burst assay en MAT (ethische commissie voor onderzoek aan Masaryk University, Brno, Tsjechië, goedkeuring nr. EKV-2018-083). Alle donoren gaven hun schriftelijke toestemming.
de oxidatieve burst (Ros-productie) van bloedfagocyten werd bepaald in verdund volbloed door met luminol versterkte chemiluminescentie (CL) met behulp van een LM-01T microplaatluminometer (Immunotech, Tsjechië). Kort, het reactiemengsel bestond uit 6 µL volbloed in 54 µl rpmi-1640 groeimedium gemengd met 60 µl verbandextract in fysiologische zoutoplossing of een FBS-aangevuld medium. Dit mengsel werd gedurende 20 minuten bij 37 °C geïncubeerd. Vlak voor het begin van de meting hebben we 1 mM luminol (een stamoplossing van 10 mM luminol in een 0,2 M boraatbuffer) toegevoegd (moleculaire Probes, USA). We bepaalden spontane Ros productie, en Ros productie geïnduceerd door opsonised zymosan deeltjes (OZP-0,1 mg / mL) (Sigma-Aldrich, USA) of phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA-0,8 µM); Sigma-Aldrich, USA). Onbehandelde monsters zonder de geteste extracten werden als controlegroep beoordeeld. De tests werden uitgevoerd in duplicaten. Chemiluminescentie werd continu gedurende 90 minuten bij 37 °C geregistreerd en werd uitgedrukt als relatieve lichteenheden (RLU). We bepaalden de totale hoeveelheid Ros-productie uit het geïntegreerde gebied onder de chemiluminescentiecurve.
Monocyte activatietest (MAT)
MAT werd uitgevoerd in 10 x met zout verdund hepariniseerd menselijk volbloed. Bloedmonsters werden verzameld bij vijf gezonde donoren, samengevoegd en verdund met zoutoplossing. De verdunde bloedmonsters werden geïncubeerd met cirkels met een diameter van 6 mm, gesneden uit het verband in steriele microbuisjes gedurende 24 uur bij 37 °C. parallel daaraan lipopolysaccharide (LPS, uiteindelijke c = 0. 25 IU / mL; endotoxine standaard e-Toxate; Sigma, US) werd toegevoegd aan de tweede reeks van monsters geïncubeerd met verbandmonsters om een aangeboren immuunrespons tegen bacteriën te stimuleren. Bloedcellen sedimenteerde tijdens de incubatie, waardoor een bovenste fase van zoutoplossing verdund plasma. Na incubatie werd 200 µL van elk met zoutoplossing verdund plasmamonster verzameld en onmiddellijk geanalyseerd in duplicaten voor IL-6 met behulp van een IL-6 Humane ongecoate ELISA-Kit volgens het Protocol van de fabrikant (ThermoFisher Scientific, US). De absorptie werd afgelezen met behulp van een EnSight Multimode Plaatlezer (PerkinElmer, US) en de uiteindelijke IL-6 concentratie werd berekend door Kaleido SW (Perkin Elmer, US). De resterende plasma-en sedimentcellen werden bewaard bij 4 °C voor de beoordeling van hemolyse en toxiciteit.
hemolyse
hemolyse werd gedetecteerd in de resterende met zoutoplossing verdunde plasma-en sedimentcellen van MAT. Na centrifugering werd 100 µL van elk monster overgebracht naar een 96-wells microplaat en werd de absorptie gemeten bij 550 nm. 1% Triton X-100 werd gebruikt als positieve controle.
LDH-afgifte
de toxiciteit van zilververbindingen op bloedcellen werd beoordeeld met behulp van een lactaatdehydrogenase (LDH) – test (Cytotoxicity Detection KitPLUS, Roche, Zwitserland) volgens de instructies van de fabrikant. Twee bronnen van bloedcellen werden gebruikt-menselijk volbloed geïncubeerd met zilveren verbanden zoals in MAT, en geïsoleerde neutrofielen. De voor achtergrondcorrectie gebruikte extinctie werd gemeten in blanco monsters zonder het LDH-reagens. De resultaten worden gerapporteerd als absolute waarden van de optische dichtheid in vergelijking met een onbehandeld Monster.
statistische analyse
indien niet anders vermeld, werd de Student t-test gebruikt om de statistische significantie van verschillen tussen monsters en onbehandelde controles te evalueren.